重組hIFN-α-2b-BCG的凍干制備及生物特性的研究*

孫二琳 趙 杰 范曉東 韓瑞發(fā)

重組hIFN-α-2b-BCG的凍干制備及生物特性的研究*

孫二琳 趙 杰 范曉東 韓瑞發(fā)△

目的：研究重組hIFN-α-2b-BCG真空冷凍干燥的制備工藝，研究?jī)龈珊笊锾匦缘淖兓７椒ǎ翰捎谜婵绽鋬龈稍锓ㄖ苽渲亟MBCG（rBCG），篩選最佳工藝參數(shù)。平板計(jì)數(shù)法比較冷凍干前后的活菌數(shù)，計(jì)算存活率。比較凍干前后rBCG的抗酸染色特征與形態(tài)，連續(xù)測(cè)定OD值，繪制生長(zhǎng)曲線，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）IFN-α-2b表達(dá)水平。PCR和抗性培養(yǎng)分析凍干后的質(zhì)粒穩(wěn)定性。結(jié)果：凍干后重組BCG為（6.51±0.33）×106CFU/mL，凍干前為（1.02±0.11）×107CFU/mL，存活率約65%，達(dá)到BCG生物免疫治療所需的活菌標(biāo)準(zhǔn)。凍干前后的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)曲線及抗酸染色特征無(wú)明顯差異。質(zhì)粒插入基因穩(wěn)定率91.7%，丟失率為8.3%。凍干前后分泌IFN-α-2b水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論：成功制備了重組hIFN-α-2b BCG凍干制劑，活菌數(shù)達(dá)到生物免疫治療標(biāo)準(zhǔn)，其生物學(xué)特性和質(zhì)粒穩(wěn)定性均可耐受冷凍、低溫與真空干燥過(guò)程中的不利影響。

干擾素α-2b 卡介苗 重組,遺傳 質(zhì)粒 冷凍干燥法 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

卡介苗（BCG）是一種牛型分枝桿菌減毒活疫苗，作為免疫佐劑在預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)及治療原位癌方面已取得較好療效[1]。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建分泌細(xì)胞因子的重組BCG可以提高其抗腫瘤活性并減少與劑量有關(guān)的不良反應(yīng)，同時(shí)可通過(guò)重組BCG持續(xù)分泌的細(xì)胞因子來(lái)克服直接使用細(xì)胞因子灌注時(shí)半衰期短、水溶性易隨尿流失及需反復(fù)大量灌注等缺點(diǎn)，成為近幾年膀胱腫瘤治療研究的熱點(diǎn)[2]。基因重組BCG因?qū)胪庠葱再|(zhì)粒，其生物活性能否長(zhǎng)期保存就尤為重要。本所已成功構(gòu)建了分泌型的表達(dá)人干擾素（hIFN）－α－2b的重組BCG[3]。目前關(guān)于基因重組IFN-α-2b-BCG的冷凍干燥制備及凍干后其生物特性、外源基因表達(dá)穩(wěn)定性的研究少見(jiàn)報(bào)道，本文對(duì)此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料 重組hIFN-α-2b BCG由本所基因工程室自行構(gòu)建保存，由hIFN-α-2b片段定向克隆至pMAO-4穿梭質(zhì)粒形成重組質(zhì)粒phIFN-α-2b，在DH5α-E.coli富集后提取電轉(zhuǎn)導(dǎo)至BCG構(gòu)建成，步驟詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]。主要試劑：谷氨酸鈉（上海天蓮精細(xì)化工有限公司），蔗糖（北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠），明膠（天津市用大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；Middlebrook 7H9 Broth和7H10 Agar購(gòu)自美國(guó)DIFCO；Kanamycin Sulfate為AMRESCO分裝；hIFN-α-2b酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biosource公司。

1.2凍干制備 重組BCG（rBCG）在含卡那抗性的7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～9 d，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（OD600值為0.85）菌液4 mL離心，雙蒸水洗滌，沉淀中加入1 mL保護(hù)液（10%蔗糖、1%明膠、1%氯化鉀、1%谷氨酸鈉），裝入西林瓶。在真空冷凍干燥機(jī)（Sublimator2-3-3/5）中，經(jīng)預(yù)凍-40℃ 5 h、第一階段干燥-30℃12 h、第二階段干燥20℃2 h，真空下壓塞制成凍干粉末。

1.3活菌計(jì)數(shù) 分別取凍前rBCG 1 mL（OD值0．85）、1/4瓶?jī)龈蓃BCG加入1 mL 7H9溶解，各加入9 mL 7H9液體培養(yǎng)基，依次稀釋4、5次（即1:10 000和1∶100 000），各取0.1 mL，7H10固體培養(yǎng)基，2種稀釋濃度各接種3個(gè)培養(yǎng)皿。置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4～6周后讀取生長(zhǎng)結(jié)果。取同一濃度3支培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落的平均數(shù)，計(jì)算出每毫升BCG中的活菌數(shù)。將凍干rBCG在4℃冰箱保存1個(gè)月后，重復(fù)上述操作。BCG 活菌數(shù)=（1∶10 000 的菌落數(shù)×10 萬(wàn)）+（1∶100 000 的菌落數(shù)×1 000 000）/2；凍干rBCG存活率=凍后活菌數(shù)/凍前活菌數(shù)×100%。

1.4質(zhì)粒穩(wěn)定性研究 挑取7H10固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的凍干后rBCG單菌落接種于2個(gè)24孔板中，每孔中有2 mL 7H9培養(yǎng)基（30 mg/L卡那霉素），37℃震搖培養(yǎng),1周后觀察結(jié)果。菌液沒(méi)有生長(zhǎng)者為質(zhì)粒脫失。隨機(jī)取10孔菌液抗酸染色。根據(jù)hIFN-α-2b序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物上游5′-CAAGGGATCCTGTGA TCTGCCTCAAACCCACAG-3′，下游 5′-GCCGGAATTCTCAT TCCTTACTTAAACTTTCTT-3′。取24孔板中擴(kuò)增的菌液1 mL，離心去上清，洗滌沉淀。加入30 μL雙蒸水，煮沸10 min。離心取上清液20 μL作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，55℃退火50 s，72℃延伸50 s，最后1次72℃延伸7 min，共25個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳分析。上下游引物雙向測(cè)序。

1.5凍前與凍后rBCG生長(zhǎng)曲線的繪制 將凍前rBCG和凍干rBCG分別接種到3瓶50 mL 7H9液體培養(yǎng)基中，每天取出2～3 mL，測(cè)定各瓶在600 nm處的OD值，3瓶測(cè)定結(jié)果取平均值作為OD值測(cè)定結(jié)果，至其停止生長(zhǎng)為止。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，分別制作凍干前后的生長(zhǎng)曲線。

1.6ELISA法檢測(cè)凍干前后hIFN-α-2b表達(dá)量 分別取1 mL rBCG（OD 值 0.85）、1/4瓶?jī)龈汕昂?rBCG（各 3瓶）接種于30 mL 7H9液體培養(yǎng)基中（含有30 mg/L卡那霉素），每天測(cè)其OD值。測(cè)OD值后取菌液1 mL，10 000 r/min離心10 min，取上清為標(biāo)本，-20℃凍存。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定分泌至上清中的IFN-α-2b。5 min內(nèi)450 nm處測(cè)定。每份樣品復(fù)孔檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品含量，取平均值作為最終結(jié)果。

1.7凍干前后rBCG進(jìn)行抗酸染色比較 將被檢物涂于玻片晾干，加Ⅰ液（碳酸復(fù)紅液）覆蓋，加熱，放涼，用水沖洗；加Ⅱ液（3%鹽酸乙醇溶液）1 min，用水沖洗；加Ⅲ液（呂弗勒氏堿性美蘭液）2 min，用水沖洗。晾干后封片，油鏡下觀察。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)采用±s表示。樣本均數(shù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多水平重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用單個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析；率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凍干rBCG外觀形態(tài) 凍干粉劑外觀為白色疏松粉末，加水后3 min內(nèi)快速溶解。凍干后rBCG的菌落外觀形態(tài)和抗酸染色與凍干前相比均無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖1。

圖1 重組BCG菌落

2.2活菌計(jì)數(shù) 凍干前檢測(cè)活菌數(shù)為（1.02±0.11）×107CFU/mL（CFU為菌落形成單位,colony formation unit），凍干后為（6.51±0.33）×106CFU/mL；存活率為65%。保存1個(gè)月后，凍干rBCG活性菌為（6.04±0.26）×106CFU/mL，存活率 60%，1個(gè)月保存對(duì)凍干狀態(tài)的活菌數(shù)無(wú)明顯影響（t=0．465，P ＞ 0．05）。

2.3生長(zhǎng)曲線 記錄生長(zhǎng)1周內(nèi)的OD值，測(cè)量時(shí)間與組別（凍干前、后組）之間無(wú)交互作用（F=0.507，P=0.605）；各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)之間的測(cè)量值差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 684.54，P<0.001）；凍干前、后組rBCG的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化（F=4．102，P＝0．113），見(jiàn)圖 2。

2.4質(zhì)粒穩(wěn)定性結(jié)果含卡那霉素的7H9培養(yǎng)基的48孔中，有4孔沒(méi)有生長(zhǎng)，見(jiàn)圖3。質(zhì)粒丟失率為8.3%。其余44孔抗酸染色證明均為抗酸桿菌特征。hIFN-α-2b片段的PCR反應(yīng)凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示在500 bp出現(xiàn)目的條帶，見(jiàn)圖4。測(cè)序結(jié)果與插入片段序列一致。

圖2 凍干前后rBCG的生長(zhǎng)曲線

2.5凍干前后hIFN-α-2b的表達(dá) ELISA法測(cè)定凍干前后重組BCG表達(dá)hIFN-α-2b的情況，不同OD值測(cè)量點(diǎn)與組別之間無(wú)交互作用（F=1.249，P=0.326）；不同OD值測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的測(cè)量值差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=65 331.85，P<0.001)；對(duì)比培養(yǎng)生長(zhǎng)至不同OD時(shí)相時(shí)，凍干前、后rBCG表達(dá)的IFN-α－2b 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3．084，P ＝ 0．272），見(jiàn)表1。

表1 凍干重組BCG生長(zhǎng)過(guò)程中IFN-a-2b 的分泌表達(dá)

表1 凍干重組BCG生長(zhǎng)過(guò)程中IFN-a-2b 的分泌表達(dá)

組別凍干前組凍干后組0.2 OD 97.5±2.6 93.6±2.1 0.4 OD 179.4±5.9 170.4±6.1 0.6 OD 368.3±8.7 356.6±7.9 0.8 OD 789.4±10.0 780.3±11.2 1.0 OD 1 226.3±14.7 1 210.3±16.3

3 討論

真空冷凍干燥系將藥物溶液在體系共熔點(diǎn)以下預(yù)凍成固體，然后在低溫低壓的條件下，從凍結(jié)狀態(tài)不經(jīng)過(guò)液態(tài)而直接升華除去水分的一種干燥方式，是長(zhǎng)期保存菌種比較好的一種傳統(tǒng)方法。該法不適合于保存嬌嫩的菌種，因必須經(jīng)歷應(yīng)激和DNA損傷，可導(dǎo)致微生物的完全死亡或者某些重要生物功能的喪失或生物突變體的產(chǎn)生。革蘭陽(yáng)性菌凍干后活菌率為80%左右，革蘭陰性菌凍干后活菌率為50%左右，可能原因?yàn)榫そY(jié)構(gòu)不同造成的菌齡和細(xì)胞濃度對(duì)凍干后活菌數(shù)有重要影響[5-7]。保存菌種的基本目的是凍干保存后細(xì)菌的活菌數(shù)、保存時(shí)間、保存后生物學(xué)特性的變化，研究的中心是選擇合適的凍干保護(hù)劑配方以及篩選最佳冷凍干燥工藝參數(shù)。本試驗(yàn)中涉及保存的菌種是重組卡介苗，含有人工轉(zhuǎn)導(dǎo)的重組質(zhì)粒，不同于野生型卡介苗。雖然凍干皮內(nèi)接種的野生型卡介苗已廣泛應(yīng)用于臨床，但關(guān)于重組卡介苗的冷凍干燥的方法保存，其活菌數(shù)、生長(zhǎng)狀況有無(wú)變化，外源蛋白能否順利表達(dá)以及重組質(zhì)粒能否耐受冷凍干燥的惡劣環(huán)境方面少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，質(zhì)粒有無(wú)脫失對(duì)維持良好的免疫原性至關(guān)重要。

冷凍干燥保存后細(xì)胞活力很高，但質(zhì)粒編碼的生物學(xué)活性可能存在喪失現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究了鼠疫桿菌、乳酸菌等冷凍干燥采用復(fù)蘇后提取質(zhì)粒電泳或基因擴(kuò)增的方法證實(shí)凍干前后質(zhì)粒變化[5-6]，但未進(jìn)一步研究質(zhì)粒脫失率和突變情況。基因工程菌的冷凍干燥更重要的是重組蛋白表達(dá)和功能的維持。鄧光存等[8]對(duì)基因工程菌株 BL21（DE3）（pECBST1）進(jìn)行了冷凍干燥保存，其存活率和冷凍保存沒(méi)有明顯差別。Sidyakina等[9]對(duì)重組大腸桿菌HB101（含有重組質(zhì)粒pHS35）保存2年發(fā)現(xiàn)：冷凍干燥（保存于4℃）后細(xì)菌存活率為2%～19%，深低溫保藏（-160℃）為 51%～100%，低溫保藏（-70℃）為60%～70%，各種方法保存后基因穩(wěn)定性均為100%。Yoon[10]進(jìn)行了含自身質(zhì)粒pKM10/pKM20假單胞菌和人工轉(zhuǎn)染包含pKM20/pKM10雙質(zhì)粒的假單胞菌的冷凍干燥，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒脫失比較嚴(yán)重；自然質(zhì)粒和人工轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的脫失率無(wú)顯著差別，隨保存時(shí)間延長(zhǎng)人工轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒更易脫失。最近關(guān)于重組BCG的研究大多數(shù)包括評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。通常通過(guò)評(píng)價(jià)rBCG保持卡那霉素抗性的百分比，作為質(zhì)粒存在的指標(biāo)。這種評(píng)價(jià)方法有其局限性，因?yàn)檫x擇標(biāo)記的存在不能區(qū)別那些外源基因缺失而選擇性標(biāo)記存在的突變體。應(yīng)該通過(guò)卡那霉素抗性的保留和目的基因片段的存在雙重標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)質(zhì)粒的完整性。

本研究結(jié)果顯示冷凍干燥能很好的保存基因工程菌hIFN-α-2b-rBCG,分析冷凍干燥過(guò)程對(duì)hIFN-α-2b-rBCG的影響發(fā)現(xiàn)，活菌數(shù)滿足免疫治療活菌數(shù)>100萬(wàn)的要求。并且證明冷凍干燥后重組BCG仍能很好地表達(dá)外源性蛋白—人干擾素-α-2b，相同OD值下表達(dá)量與冷凍干燥前沒(méi)有顯著差別。冷凍干燥后的形態(tài)、生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯變化。外源質(zhì)粒基本可以耐受冷凍干燥過(guò)程中的不利環(huán)境，僅發(fā)現(xiàn)存在少量質(zhì)粒脫失現(xiàn)象，質(zhì)粒未缺失株均可檢測(cè)到IFN-α-2b完整目的片段，故不影響重組BCG的臨床應(yīng)用。

[1] Lam JS,Benson MC,O’Donnell MA,et al.Bacillus Calmete-Guerin plus interferon-alpha2B intravesical therapy maintains an extended treatment plan for superficial bladder cancer with minimal toxicity[J].Urol Oncol,2003,21(5):354-360.

[2] Dennehya M,Williamson AL.Factors influencing the immune response to foreign antigen expressed in recombinant BCG vaccines[J].Vaccine,2005,23(10):1209-1224.

[3] 孫二琳,劉春雨,韓瑞發(fā),等.重組hIFN-α-2B-BCG的生物學(xué)特性的觀察[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,2010,30(1):46-51.

[4] 劉春雨,韓瑞發(fā).PhIFN-α-2B穿梭質(zhì)粒在卡介苗中的表達(dá)[J].中華泌尿外科雜志,2006,27(4):12-15.

[5] 劉振明,駱承庠.乳酸菌凍干特性的研究 [J].中國(guó)乳品工業(yè),2002,30(5):38-42.

[6] 張麗云.冷凍干燥長(zhǎng)期低溫保存后鼠疫菌某些生物學(xué)的研究[J].中國(guó)地方病雜志,1996,11(5):43-45.

[7] 鄭從義,屈三甫,陶天申,等.極端嗜鹽菌凍干保藏及其質(zhì)粒穩(wěn)定性的研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào),1995,41(6):56-64.

[8] 鄧光存,呂玉玲,王玉炯.基因工程菌株BL21(DE3)(pECB-ST1)菌種的限定代次及保存條件試驗(yàn)[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,23(2):24-26.

[9] Sidyakina TM,Golimbet VE.Viability and genetic stability of the bacterium escherichia coli HBl101 with the recombinant plasmid during preservation by various methods[J].Cryobiology,1991,28(3):251-254.

[10] Yoon KP.Stabilities of artificially transconjugated plasmids for the bioremediation of cocontaminated sites[J].J Microbiol,2005,43(2):196-203.

Lyophilization-Preparation and Biological Characteristics of Recombinant hIFN-α-2b-BCG

SUN Erlin,ZHAO Jie,FAN Xiaodong,HAN Ruifa

Tianjin Institute of Urology,The second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective:To explore the preparation process of lyophilization of recombinant hIFN-α-2b-BCG(rBCG),and the biological characteristics of lyophilized rBCG thereof.Methods:It was used to determine the optimum process parameters that preparation by vacuum freeze-drying recombinant rBCG.The number of viable cells was compared with the plate count before and after lyophilization to calculate the survival rate.The acid-fast staining characteristics and morphology of the lyophilized rBCG were analyzed.The OD value of freeze-dried rBCG was continuously measured for drawing the growth curve.The level of IFN-α-2b expression was determined by ELISA.The plasmid stability was analysed by PCR.Results:The number of viable rBCG reached （6.51±0.33）×106CFU/mL after lyophilization.The value was （1.02±0.11）×107CFU/mL before freeze-drying,and the survival rate was about 65%.The viable number achieved the required standard of bio-immunotherapy.There were no significant differences in morphology,growth rate and acid-fast staining characteristics of lyophilized rBCG compared with those of un-lyophilized.The stability rate of gene inserted(hIFN-α-2b)was 91.7%,loss rate 8.3%.There was no significant difference in the level of secretion of rIFN-α-2b by rBCG after lyophilization(P>0.05).Conclusion:Freezedried powder of hIFN-α-2b-rBCG was successfully prepared,which was without significant adverse effects on the hIFN-α-2b expression,plasmid insert and bio-characteristics.

interferon alfa-2b BCG vaccine recombination,genetic plasmids freeze drying enzyme-linked immunosorbent assay

*國(guó)家科技部“十一五”重大專(zhuān)項(xiàng)新藥創(chuàng)建課題（項(xiàng)目編號(hào)：2009ZX09103-699）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：30872587）；天津市科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：07ZCKFSH03200）

300211 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、天津市泌尿外科研究所

△通訊作者 E-mail:miyansuo@126.com

（2010-07-18收稿 2010-10-08修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）