MMP-3 5A/6A基因多態性在急性冠脈綜合征中的作用

杜紀兵 孟冬梅 劉 寅 毛用敏 高 靜 陳樹濤 叢洪良

MMP-3 5A/6A基因多態性在急性冠脈綜合征中的作用

杜紀兵 孟冬梅 劉 寅 毛用敏 高 靜 陳樹濤 叢洪良△

目的：研究基質金屬蛋白酶（MMP-3）啟動子區域5A/6A基因多態性是否參與了急性冠脈綜合征發生、發展過程。方法：將因胸部不適行冠狀動脈（冠脈）造影的389例患者，根據臨床癥狀及冠脈造影檢查結果分為急性冠狀動脈綜合征（ACS）組（232例）和對照組（157例），分別進行2組患者臨床資料對比及血液學標本基因多態性、MMP-3含量檢測。ELISA法檢測MMP-3含量，PCR法測基因多態性。結果：ACS組攜帶突變型基因患者比例明顯高于對照組（36.21%vs 24.84%,P<0.05）；ACS組攜帶MMP-3 5A等位基因頻率明顯高于對照組（18.97%vs 6.53%,P<0.01）；ACS組MMP-3血清含量也明顯高于對照組[（12.37±2.96）μg/L vs（9.59±2.77）μg/L,P<0.05]。結論：攜帶MMP-3 5A等位基因患者更易導致動脈粥樣硬化斑塊的破裂，從而觸發急性冠脈綜合征的發生。

基質金屬蛋白酶-3 多態現象,遺傳 基因 急性冠狀動脈綜合征

目前研究證實，動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的破裂以及即發血栓形成是急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome,ACS）發生、發展的首要原因[1]。雖然纖維帽破裂的具體機制尚未闡明，但是近年來研究表明基質金屬蛋白酶家族（matrix metalloprotinases,MMPs）因能降解多種細胞外基質（extracellular matrix,ECM）成分，從而在纖維帽的變薄及破裂過程中發揮關鍵作用[2]。MMP-3作為MMPs家族的重要一員，其啟動子區域-1612位點5A/6A基因多態性逐漸受到關注。有研究證實5A等位基因表達活性明顯強于6A等位基因[3]。本研究旨在探討MMP-3基因多態性是否參與ACS發生、發展過程。

1 資料與方法

1.1一般資料 所有受試者均為天津市胸科醫院2006年1月—2007年6月因胸部不適住院治療患者共389例。根據診斷及檢查結果分為2組：（1）對照組157例，經血液生化、胸片、心電圖及冠狀動脈（冠脈）造影檢查排除心臟病、高血壓及糖尿病等疾患，且肝腎功能正常。（2）ACS組232例，均符合1979年WHO冠心病診斷標準，并且經冠狀動脈造影證實冠狀動脈中至少有一支血管狹窄≥50%。2組一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 2組一般資料比較

1.2MMP-3血清含量檢測及MMP-3基因多態性檢測 采用ELISA法檢測2組患者血清中MMP-3含量，應用Thermo MULTISKAN MK3 ELISA檢測儀進行測定，試劑購自上海森雄科技有限公司。從受試者的白細胞中提取DNA，應用德國Eppendrof PCR儀擴增目的基因片段，基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：上游5′-GGTTCTCCA TTCCTTTGATGGGGGGAAAAG-3′；下游 5′-CTTCCTGGAAT TCACATCGAAACCACT-3′，擴增含MMP-3啟動子區域-1 612位點目的基因129 bp大小片段。PCR反應基本條件為：95℃預變性3 min;變性95℃3 min，退火63℃30 s，延伸72℃1 min共35個循環。應用特異性的限制核酸內切酶Tth 111Ⅰ（GACN/NNGTC）進行酶切后，3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定MMP-3基因。

1.3統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件。計量資料以±s表示，2組間均值比較用t檢驗，應用基因計數法計算等位基因頻率，經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律做吻合度檢驗。采用χ2檢驗，進行等位基因頻率和基因型頻率計算，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MMP-3基因多態性檢測結果 在PCR產物5A/6A多態位點處產生了一個限制性內切酶Tth111Ⅰ的識別序列。含5A等位基因的純合子PCR產物被該酶切為97、33 bp大小2個片段，而6A/6A純合子不被酶切，為1條129 bp的片段，5A/6A雜合子則為129、97、33 bp大小3個片段，見圖1。MMP-3基因型分為野生型基因（6A/6A，n=266）和突變型基因型（5A/5A+5A/6A，n=123），2組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（χ2分別為1.76和1.31，P>0.05）。ACS組攜帶突變型基因型比例及攜帶5A等位基因頻率均明顯高于相應對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.2MMP-3血清含量測定 ACS組MMP-3含量明顯高于對照組，差異有統計學意義[（12．37±2．96）μg/L vs（9．59±2．77）μg/L,t＝ 3．284，P ＜ 0．05]。

圖1 MMP-3啟動子基因片段PCR產物酶切結果

表2 MMP-3基因多態性分析結果比較

3 討論

研究發現，動脈粥樣硬化斑塊局部的炎癥和遺傳因素在斑塊不穩定性方面發揮至關重要的作用[4]。MMPs作為一種Zn2+和Ca2+依賴性的內肽酶家族參與了血管重塑和炎癥細胞侵入血管壁過程[5]。盡管MMPs的激活能夠減少ECM含量，從而限制動脈粥樣硬化斑塊的進展，但是局部MMPs不協調激活則能夠導致動脈粥樣硬化斑塊纖維帽變薄和破裂，從而引起ACS的發生[6]，MMP-3作為MMPs中的重要一員在此過程中發揮重要作用[7]。MMP-3不僅能降解膠原蛋白Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ、Ⅹ，蛋白聚糖、纖維連接蛋白及層粘連蛋白等多種細胞外基質成分，且可激活MMP-1、8、9及13前體并能夠自身激活，引起ECM降解瀑布效應[8]。Henney等[9]通過原位雜交方法證實動脈粥樣硬化斑塊中平滑肌細胞和巨噬細胞內均可見MMP-3表達，尤其是在趨于斑塊破裂的部位，從而導致纖維帽的變薄進而趨于破裂。

MMP-3基因序列位于11號染色體長臂11q22.2-22.3位點，其基因多態性常見突變位于MMP-3啟動子上游-1 612位點5A和6A突變?；A研究證實通過體外成纖維細胞和中膜平滑肌細胞短暫表達，攜帶5A等位基因表達活性是攜帶6A等位基因的2倍[10]。一項大于6 000例患者的臨床薈萃分析顯示，6A/6A等位基因與冠脈造影證實的動脈粥樣硬化進展密切相關，分析原因與MMP-3 6A等位基因表達活性明顯弱于5A等位基因，從而加速ECM的積聚有關[11]。但是攜帶5A等位基因患者是否容易引起ACS發生尚有待驗證。本研究顯示ACS患者中攜帶突變型基因型比例以及5A等位基因頻率均明顯高于對照組。因此筆者推測，在某些外界環境刺激下攜帶MMP-3 5A等位基因患者由于5A等位基因表達活性明顯高于6A等位基因，從而導致冠狀動脈粥樣硬化斑塊局部MMP-3含量增加，致使局部纖維帽不穩定性增加，引起斑塊破裂，進而導致臨床急性冠脈綜合征發生。另外，Kelly等[12]通過觀察382例急性心肌梗死患者發現MMP-3血清含量在急性心肌梗死患者中明顯升高。Inoue等[13]通過對比20例ACS患者與20例非ACS患者發現，MMP-3血清含量在ACS患者中亦明顯升高。本研究中亦發現ACS組MMP-3血清含量明顯高于對照組，提示MMP-3表達含量的增加促使局部動脈粥樣硬化斑塊不穩定性增加，引起ACS發生。

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The role of MMP-3 5A/6A Polymorphism in Acute Coronary Syndrome

DU Jibing,MENG Dongmei,LIU Yin,MAO Yongmin,GAO Jing,CHEN Shutao,CONG Hongliang

Tianjin Chest Hospital,Tianjin,300051,China

Objective:To investigate the relationship between matrix metalloprotinase(MMP)-3 5A/6A polymorphism and acute coronary syndrome(ACS).Methods:Three hundred and eighty nine patients were divided into ACS group(n=232)and control group(n=157)according to the clinical syndrome and coronary angiography results after admission.The clinical data and blood samples were collected in the two groups.Results:The results showed that there were significantly more patients carried 5A/6A+5A/6A gene type in ACS group than those of control（36.21%vs 24.84%,P<0.05).The number of patients with 5A allele frequency was also higher in ACS group than that in control group（18.97%vs 6.53%,P<0.001).On the other side,the result showed that there was a higher level of serum MMP-3 in ACS group compared with that of control group[（12.37±2.96） μg/L vs （9.59±2.77） μg/L， P<0.05）].Conclusion:Patients who carried MMP-3 5A allele were more likely lead to atherosclerotic plaque rupture,and thus trigger the occurrence of ACS.

matrix metalloproteinase 3 polymorphism,genetic genes acute coronary syndrome

300051 天津市胸科醫院

△通訊作者 E-mail:hongliangcong@126.com

（2010-02-08收稿 2010-03-10修回）

（本文編輯 陸榮展）

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