抗氧化劑對急性肺損傷大鼠細胞因子的影響研究*

劉 薇 張 慧 常 誠 林書祥 趙津生 鄭 捷 黃敬孚

抗氧化劑對急性肺損傷大鼠細胞因子的影響研究*

劉 薇 張 慧△常 誠 林書祥 趙津生 鄭 捷 黃敬孚

目的：探討急性肺損傷（ALI）的發病機制及抗氧化劑對ALI大鼠細胞因子的影響。方法：健康、成熟Wistar大鼠60只隨機平均分為模型組和治療組，2組均以大腸桿菌腹腔注射，建立ALI動物模型。治療組在注射大腸桿菌30 min后，經大鼠尾靜脈注射還原型谷胱甘肽。分別于注射大腸桿菌后3、6、12 h測定2組血中IL-8、IL-10的變化。結果：模型組注射大腸桿菌后3 h出現ALI癥狀，6 h更為明顯，12 h口吐粉紅色分泌物，解剖后肉眼所見雙肺有明顯水腫及出血點，氧合指數及肺濕/干重比均達到ALI診斷標準。治療組3 h無明顯變化，6 h呼吸稍促，12 h肺組織僅輕度水腫。在使用還原型谷胱甘肽后，治療組肺濕/干重比各時段檢測值均低于模型組，其中6、12 h差異有統計學意義（P<0.05）；IL-8檢測值各時段均低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）；IL-10檢測值各時段均高于模型組，6、12 h差異有統計學意義（P<0.05）。結論：ALI時存在炎性介質的失控與失衡，應用還原型谷胱甘肽后可有效調控炎性介質，從而降低ALI的發生概率。

呼吸窘迫綜合征,成人 疾病模型,動物 谷胱甘肽 白細胞介素8 白細胞介素10 細胞因子類大鼠,Wistar

急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是常見危重癥，病死率極高，其基本病理生理改變是肺泡上皮和肺毛細血管內皮通透性增加所致的非心源性肺水腫，在疾病發展過程中有多種細胞因子參與[1]。還原型谷胱甘肽主要存在于細胞胞漿內，對維持細胞的正常代謝，保護細胞膜的完整性具有重要的生化功能作用[2]。本實驗通過建立ALI動物模型，檢測其在應用抗氧化劑（還原型谷胱甘肽）前后炎性細胞因子白細胞介素（IL）－8、IL－10表達的變化，探討抗氧化劑對ALI細胞因子的影響效應。

1 材料與方法

1.1材料 （1）實驗動物。健康、成熟Wistar大鼠60只，購自天津醫科大學動物實驗室，雌雄各30只。隨機分為2組，模型組30只，雌雄各15只，平均體質量（198.4±12.7）g，平均（4.20±0.13）月齡；治療組30只，雌雄各15只，平均體質量（196.8±12.1）g，平均（4.19±0.13）月齡。2組平均體質量（t=0.499 6）、月齡（t=0.2）差異均無統計學意義（P>0.05）。（2）儀器與試劑。美國NOVA PHOX全自動血氣分析儀，大腸桿菌（O11B4，美國Sigma公司），還原型谷胱甘肽（積華藥業有限公司），烏拉坦（武漢銀河化工有限公司），福爾馬林（江蘇永華精細化學品有限公司）。

1.2方法 模型組和治療組均以大腸桿菌2 mL/kg腹腔注射，以氧合指數[p（O2）/FiO2]≤300 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、肺濕/干重比、肺組織病理改變為標準，成功建立ALI動物模型[3]。治療組在注射大腸桿菌30 min后，經大鼠尾靜脈注射還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）800 mg/kg。各組內大鼠每10只為一批分別在注射大腸桿菌后3、6、12 h，用烏拉坦麻醉，經腹主動脈取血，即刻送血氣分析，其余部分離心保存。大鼠氣管插管，用生理鹽水做肺灌洗，回收率90%，回收液離心保存，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法測定血中IL-8、IL-10的變化。大鼠處死后取右肺下葉組織于10%福爾馬林液中固定，左肺稱體質量，并自然干后再稱體質量，計算肺濕/干重比。

1.3統計學處理 所有數據采用SPSS 13.0軟件處理，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用成組t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1一般情況比較 注射大腸桿菌后，模型組大鼠3 h組出現呼吸稍促、寒戰、毛發潮濕現象，6 h組上述現象更為明顯，12 h組口吐粉紅色分泌物，解剖后肉眼可見雙肺有明顯水腫及出血點，氧合指數及肺濕/干重比均達到ALI診斷標準；治療組大鼠3 h組無明顯變化，6 h組呼吸稍促，12 h組肺組織僅輕度水腫。

2.2肺濕/干重比檢測結果 治療組大鼠肺濕/干重比在3、6、12 h時檢測值均低于相應模型組，6、12 h時2組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 2組大鼠肺濕/干重比檢測結果比較

表1 2組大鼠肺濕/干重比檢測結果比較

*P ＜ 0．05，表 2、3 同

組別治療組模型組t n 10 10 3 h 6.88±1.98 7.77±1.71 1.07 6 h 5.90±1.00 9.18±4.13 2.44*12 h 7.03±1.50 10.66±1.72 5.03*

2.3IL-8、IL-10檢測結果 治療組 3、6、12 h時IL-8值低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表 2。治療 3、6、12 h 時 IL-10 值高于模型組，6、12 h 時差異有統計學意義（P<0.05），見表 3。

表2 2組大鼠IL-8檢測結果比較

表2 2組大鼠IL-8檢測結果比較

組別治療組模型組t n 10 10 3 h 8.93±0.81 10.52±0.71 4.67*6 h 8.73±1.08 10.72±0.99 4.28*12 h 9.70±1.06 11.56±1.09 3.89*

表3 2組大鼠IL-10檢測結果比較

表3 2組大鼠IL-10檢測結果比較

組別治療組模型組t n 10 10 3 h 0.37±0.35 0.25±0.11 1.05 6 h 0.48±0.30 0.26±0.07 2.33*12 h 0.29±0.10 0.17±0.09 2.78*

2.4病理觀察 模型組大鼠注射大腸桿菌后，肺泡上皮細胞嚴重損傷。其3 h（早期）表現以肺泡高滲出性水腫為特點，見圖1；6 h（中期）出現肺泡間隔增寬、炎性細胞浸潤，見圖2；12 h（晚期）Ⅱ型肺泡上皮細胞沿肺泡腔間隔增生，纖維原細胞增殖，肺泡內出血、過度充氣及部分肺泡破裂，見圖3，炎性細胞浸潤、局部肺實變，見圖4。治療組ALI大鼠3、6、12 h肺組織基本正常，病理變化輕微，見圖5。

圖1 模型組3 h肺泡高滲出性水腫（HE×400）

圖2 模型組6 h肺泡間隔增寬，炎性細胞浸潤（HE×400）

圖3 模型組12 h過度充氣，部分肺泡破裂融合（HE×100）

圖4 模型組12 h炎性細胞浸潤，局部肺實變（HE×100）

圖5 治療組肺組織均基本正常（HE×100）

3 論討

細胞因子和趨化因子是一類生物活性多樣的活性蛋白，可促進局部和全身的炎癥反應。既往研究表明，ALI既是全身炎性反應在肺部的表現，也是機體正常炎性反應過度的結果，肺血管通透性增加與過度或失控性炎癥反應有關，炎性細胞和炎性介質構成了ALI炎性反應和免疫調節的“細胞網絡”和“細胞因子網絡”[4]。在炎癥反應中，促炎性介質與抗炎性介質經常處在平衡、失衡相互對立統一的變化之中，因而，深入研究促炎因子和抗炎因子在炎性反應中的變化規律有助于對ALI/ARDS發病機制的認識[5]。

IL-8又名中性粒細胞趨化因子，屬于促炎性介質，是由單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞和T細胞等多種細胞產生的一種多肽因子，主要參與內皮細胞的黏附過程。IL-10是抗炎因子的關鍵，具有廣泛的生物學活性，在肺中具有抗感染作用，能抑制單核細胞產生IL-8，故被認為是機體限制內源性反應的內源性機制之一。本研究發現，模型組大鼠的細胞因子IL-8呈增高趨勢，IL-10呈降低趨勢，證實ALI時存在炎性介質的失控與失衡。因此，筆者認為如果可以有效抑制IL-8的分泌，提高IL-10的活性，就可能從調控細胞炎性因子著手干預ALI的發生和發展。

谷胱甘肽（glutathione）廣泛分布于人體肝、腎細胞和紅細胞，由GSH和氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）組成，兩種形式可以互變[6]。ALI時氧化應激增強，肺組織細胞內氧化-抗氧化失衡，如GSH氧化還原系統表現為GSH氧化型增加而還原型減少，GSH在血中、肺泡上皮襯液及肺部其他細胞中含量降低[7]，同時亦有文獻報道顯示GSH對大鼠呼吸機相關性肺損傷具有一定保護作用，并認為其作用機制可能與氧化、凋亡有關[8]。

本研究顯示，治療組大鼠IL-8檢測值各時段皆低于模型組，且差異均存在統計學意義，IL-10檢測值各時段皆高于模型組，在6、12 h差異存在統計學意義，提示應用GSH可有效調控炎性介質，降低ALI的發生率。鑒于目前ALI的發病機制尚未完全明確，ALI的發病機制及抗氧化劑對ALI的其他影響有待進一步研究。

[1] 中華醫學會重癥醫學分會.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南（2006）[J].中國實用外科雜志，2007，27（1）:1-6.

[2] 黃中偉，唐建忠，袁鼎山，等.還原型谷胱甘肽對急性胰腺炎全身炎癥反應綜合征的治療作用[J].中華急診醫學雜志,2005,14（12）:148-150.

[3] 崔華雷，秦明放，魯煥章，等.急性重癥膽管炎致急性肺損傷動物模型的制作[J]，天津醫科大學學報,2000,6（4）:40-42.

[4] 陳成，黃建安.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征預后評估指標研究進展[J].中國呼吸與危重監護雜志，2008，7（2）:81-85.

[5] Goodman RB,Pugin J,Lee JS,et al.Cytokine-mediated inflammation in acute lung injury[J].Cytokine Growth Factor Rev,2003,14（6）:523-535.

[6] 李斌晨，吳明營，蒙革，等.還原型谷胱甘肽臨床研究及應用進展[J].中國醫療前沿,2008,3（6）:9-10.

[7] 張宏，劉文操.谷胱甘肽對內毒素致大鼠急性肺損傷的保護作用[J].廣東醫學,2007,28（5）:701-703.

[8] 胡乃浩，趙文靜.還原型谷胱甘肽對大鼠呼吸機相關性肺損傷的保護作用[J].徐州醫學院學報，2010，30（1）:14-17.

Effect of Anti-Oxidant on Cytokines of Acute Lung Injury in Rats

LIU Wei,ZHANG Hui,CHANG Cheng,LIN Shuxiang,ZHAO Jinsheng,ZHENG Jie,HUANG Jingfu

Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300074，China

Objective：To investigate the pathogenesis of acute lung injury(ALI),and the effect of anti-oxidants on cytokines of ALI in rats.Methods：Sixty Wistar rats were randomly divided into 2 groups,the model group and the treatment group.The animal model of ALI was established by intraperitoneal injection of Escherichia（E.）coli.The anti-oxidant,reduced glutathione,was injected by the rat tail vein 30 min after injection of E.coli in rats of treatment group.The levels of serum IL-8 and IL-10 were detected 3,6 and 12 h after injection of E.coli.Results：The symptom of ALI appeared 3 h after injection of E.coli,and was more serious after 6 h in rats of the model group.There were anatomical lung edema and bleeding points 12 h after injection of E.coli in rats of the model group.The oxygenation index and lung wet/dry weight ratio reached the diagnostic criteria of ALI.There was no significant change after 3 h,rapid breath after 6 h and only mild lung edema after 12 h in rats of the treatment group.The value of lung wet/dry weight ratio was lower in rats of treatment group than that of model group,which was significantly different after 6 and 12 h treatment(P<0.05).The levels of IL-8 w ere lower at various time points in treatment group than those of model group(P<0.05).The levels of IL-10 were significantly higher at different detection time points in treatment group than those of model group (P<0.05).Conclusion：There was an imbalance and uncontrol of inflammatory mediators in acute lung injury.After application of reduced glutathione,inflammatory mediators can be effectively controlled,thereby reducing the occurrence probability of the acute lung injury.

respiratory distress syndrome,adult disease models,animal glutathione interleukin-8 interleukin-10 cytokines rats,Wistar

*天津市衛生局科技基金項目（項目編號：02KZ14）

300074 天津市兒童醫院兒童重癥監護病房△

E-mail：chui853@yahoo.com.cn

（2010-03-30收稿 2010-05-25修回）

（本文編輯 陸榮展）

短篇論著