西瓜多倍體鑒定方法的研究

施先鋒，彭金光，李煜華，曾紅霞，杜念華，汪李平

(1.湖北省武漢市農業科學研究所，湖北 武漢 430051;2.華中農業大學 園藝林學學院，湖北 武漢 430070)

三倍體西瓜兼具多倍體優勢和雜交優勢，由于無種子，能使更多的養分轉化為糖，具有品質更好、食用方便、耐貯運等諸多優良品質特點，而且也有較強的抗病性和抗逆性，因此倍受消費者歡迎。而三倍體西瓜種子是通過以四倍體為母本，二倍體為父本進行雜交獲得的，因此誘導西瓜四倍體的研究顯得尤為重要。而在四倍體育種中，通過秋水仙素誘導獲得的植株往往出現不同倍性的嵌合體、甚至八倍體，因此，有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進一步應用的基礎。雖然有關倍性鑒定已有較多報道［1-2］，但有關西瓜染色體倍性鑒定方法系統的研究甚少。本研究試圖通過研究、比較各種倍性鑒定方法，建立一套簡便、準確、高效的西瓜倍性鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試3個西瓜品種均來自華中農業大學西甜瓜實驗室的二倍體及秋水仙素誘導獲得的同源四倍體，編號為 TS、MY和0517。栽植于華中農業大學國家蔬菜改良中心華中分中心的試驗大棚中，采用立體栽培方式，單蔓整枝，田間管理同一般大棚。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態學鑒定法

根據植物多倍體形態特征［3］，結合田間生長情況，觀察植株的葉片、花瓣大小及果皮厚度等特征進行初步鑒定。

1.2.2 流式細胞儀鑒定法

采用德國Partec公司的PA流式細胞儀(Ploidy Analyser-I，Partec)檢測倍性。在華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室進行。該倍性分析儀帶PC和自動分析及倍性判別軟件。試驗方法參考張俊娥等［4］。

1.2.3 根尖染色體計數法

染色體制片方法采用去壁低滲法［5］，在Olympus BH-2型顯微鏡觀察和照相記錄。1.2.4 葉綠體計數法

待植株長至坐果期時，9:00時，田間取幼嫩葉片，撕取葉片下表皮，置于載玻片上，滴1滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，在AH3-RFCA型Olympus萬能熒光顯微鏡下觀察氣孔保衛細胞。在分辨率為2 040×1 536的條件下照相并計算葉綠體數。

1.3 數據處理

用SPSS15.0做配對樣本t檢驗和單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

四倍體植株伸蔓期比二倍體生長要緩慢些，但幼苗出現分枝后，快速生長。

由圖1可見四倍體的葉片比二倍體的葉片大而且厚，顏色也較深;雄花花瓣大且厚，顏色更為鮮艷，花柄更長和粗;四倍體的果皮比二倍體的厚，種子少且厚。

2.2 DNA流式細胞儀倍性鑒定

試驗結果顯示，二倍體植株主峰熒光強度位于50 AU(圖2中A)，而四倍體主峰熒光強度位于約100 AU(圖2中B)，說明四倍體植株細胞DNA含量為二倍體的2倍。

2.3 染色體數目鑒定

染色體壓片觀察二倍體的根尖染色體數均為2n=2x=22(圖3中 a)，四倍體的染色體數目則為2n=4x=44(圖3中b)，是二倍體的2倍。

圖1 二倍體與四倍體的形態學比較

圖2 植株葉片中DNA含量分布曲線

圖3 二倍體 (a)與四倍體 (b)的染色體

2.4 氣孔保衛細胞中葉綠體計數法

由表1可見，相對二倍體的氣孔保衛細胞葉綠體數而言，對應同源四倍體的葉綠體數均有所增加。配對樣本 t檢驗結果表明，t=-13.22，t檢驗的雙尾顯著性概率0.006＜0.01，表明二倍體和四倍體間的葉綠體數差異達極顯著水平。經單因素方差分析，二倍體不同品種間的F分布的顯著性概率0.68＞0.05，四倍體的概率0.27＞0.05，說明同一倍性不同品種間葉綠體數差異不顯著。

綜上所述，不同倍性間差異極顯著，而同一倍性不同品種間葉綠體數差異不顯著。因此，氣孔保衛細胞葉綠體數目可作為染色體倍性的鑒定依據之一。從圖4可清晰區分不同倍性西瓜氣孔保衛細胞葉綠體數的差異。

表1 二倍體和四倍體氣孔保衛細胞中葉綠體數比較

圖4 西瓜不同倍性氣孔保衛細胞及其葉綠體數

3 小結與討論

在誘導西瓜多倍體過程中，準確及時鑒定出四倍體不僅可縮短育種周期，還能提高四倍體育種工作效率。郭啟高等［6］在離體培養過程中利用不定芽葉尖染色體計數，在組織培養早期100%檢出倍性。利用流式細胞儀可快速檢測出西瓜再生芽倍性［7］。譚素英［8］研究認為在西瓜上葉片保衛細胞的大小、單位面積上的氣孔數及保衛細胞中葉綠體的大小和數目與倍性具有高度的相關性。二倍體和四倍體西瓜植株在形態上有比較明顯的差別。Compton等［9］研究發現子房直徑、雄花的花瓣和花粉囊直徑、葉長與葉寬比是西瓜倍性水平很好的標志。本試驗結果表明:染色體計數法作為直接的倍性鑒定方法，精確、可靠，但費時且需要熟練的細胞學操作技術;流式細胞儀可用于西瓜的早期倍性鑒定;保衛細胞葉綠體數目與西瓜倍性密切相關，是有效的間接方法;二倍體和四倍體植株在長勢、花冠形態、果皮厚度及種子數量和厚度等方面有明顯差異，也能初步確定西瓜倍性，但要在較晚時期鑒定，難以及時采取加倍等措施，使育種材料不能得到充分利用。

［1］ 劉文革，閻志紅，饒小莉.不同倍性西瓜的葉表皮微形態特征比較 ［J］.果樹學報，2005(1):31-34.

［2］ Compton M E，Barnett N ，Gray D J.Use of fluorescein diacetate(FDA)to determine ploidy of in vitro watermelon shoots ［J］.Plant Cell Tissue Org Cult，1999，58:199-203.

［3］ 王志敏，牛義，宋明，等.多倍體誘導在蔬菜育種上的應用［J］.生物學雜志，2004，21(6):35-38.

［4］ 張俊娥，劉繼紅，鄧秀新.采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異 ［J］.遺傳學報，2003，30(2):169-174.

［5］ 馬雙武，劉君璞，王吉明，等.西瓜種質資源描述規范和數據標準 ［M］.北京:中國農業出版社，2006.

［6］ 郭啟高，宋明，楊天秀，等.西瓜試管苗中四倍體鑒定方法研究 ［J］.西南農業大學學報，2000，22(3):298-300.

［7］ Zhang X P，Rhodes B B，Whitesides J F.Shoot regeneration from immature cotyledons of watermelon ［J］. Cucurbit GenetCoop Rep，1994，17:102-105.

［8］ 譚素英.西瓜不同倍體葉保衛細胞中葉綠體數觀察 ［J］.果樹科學，1985，2(1):34-36.

［9］ Compton，M E，Gray D J ，Elmstrom G W.Identification of tetraploid regenerants from cotyledons of diploid watermelon cultured in vitro ［J］.Euphytica，1996，87:165-172.