根癌農桿菌介導的大麥幼胚遺傳轉化影響因素研究

李靜雯 張正英

(甘肅省農業科學院生物技術研究所， 甘肅 蘭州 730070)

禾谷類作物的遺傳轉化現已廣泛用于改良作物品質，也是功能基因組學研究的有力手段[1]。大麥作為世界上第四大糧食作物在全球100多個國家廣泛種植。除了其自身的重要研究價值，大麥(二倍體)也可作為研究其他遺傳背景更為復雜的六倍體禾谷類作物(如小麥)的模式作物。因此建立一個高效、穩定的大麥遺傳轉化體系是十分必要的。

大麥的遺傳轉化始于20世紀90年代。1994年Wan等利用基因槍介導法獲得了世界上第一例可育轉基因大麥[2]。1997年Tingay 等首次建立了農桿菌介導的大麥幼胚遺傳轉化程序，并成功獲得了大麥轉基因植株[3]。Trifonova[4]、Wu[5]、Murray[6]、Shrawat[7]、Hensel[8]等相繼報道了提高農桿菌轉化大麥頻率的影響因素，如大麥基因型和外植體、菌株和載體、胚的大小及處理方式、預培養時間、共培養條件、乙酰丁香酮(AS)的作用、培養基成分等。

雖然以花藥、小孢子、莖端分生組織、原生質體及剝離的子房做為轉化受體相關研究也獲得成功[9-12]，但是要獲得較高的遺傳轉化效率，幼胚仍然是首選的轉化受體[13]。與基因槍介導法相比，農桿菌介導法具有操作簡單、成本低、轉化效率高、重復性好，可以導入大片段的DNA等優點，而且導入的基因一般為單拷貝整合，獲得的轉基因株系其后代基因表達更穩定，且轉基因沉默現象較少[14]。因此本研究以大麥幼胚為轉化受體，選擇根癌農桿菌介導大麥遺傳轉化的幾個重要影響因素進行比較和優化，旨在為進一步建立大麥幼胚遺傳轉化體系奠定基礎，促進大麥基因工程育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料。供試大麥品種Golden Promise由中國農科院品資所提供，Schooner，甘啤4號，秀81-47，秀麥1號由甘肅省農科院啤酒原料研究所大麥育種組提供，共計5個大麥品種。大麥種子播種于大田后進行常規的田間管理。

1.1.2 菌株和質粒。根癌農桿菌菌株為C58c1，EHA105。試驗所用質粒為pVec-8-gus，從澳大利亞引進。該質粒T-DNA 區帶有β-葡萄糖苷酸酶( gus) 基因和新霉素磷酸轉移酶(NPTⅡ)基因，分別由CaMV35S 和Ubi啟動子驅動。

1.2 試驗方法

設計了4 種影響因素，分別為預培養天數、 侵染時間、菌液濃度、共培養基等，在這些因素內依次設置 4、 3、 3和 2 個處理水平。各因素、 各處理包含的個體數目不一致，為了分析方便，逐個比較各因素內不同處理水平。

1.2.1 培養基成分。本試驗共用6種培養基，其成份見表1。

1.2.2 大麥幼胚的預培養。大麥開花后12～14d剪下幼穗, 剝出籽粒。70%的酒精表面消毒1min，再用20% 的NaClO消毒8～10min, 無菌水沖洗3～4次。在超凈工作臺用鑷子剝取幼胚，去軸后盾片朝上接種于預培養基，24±1℃暗培養，預培養天數設為1d，4d，5d，6d。

表1 根癌農桿菌介導法遺傳轉化大麥幼胚所用的培養基成分

1.2.3 農桿菌接種菌液的準備。感染前2～3d 從-70℃冰箱中取出農桿菌，在冰上融化后劃線培養，接種于含50mg/L Rif，50mg/L Gta(慶大霉素)或50mg/L Str(鏈霉素)的YEP 固體培養基中，28 ℃，暗培養2～3d，之后挑取單菌落于28 ℃，200 r/min 過夜培養。吸取2 ml 培養物轉入50 ml 含50 mg/L Gta、50 mg/L Rif 的YEP 培養基中，28 ℃、250 r/min 繼續暗培養至OD600 = 0.6～1.0 。將菌液轉至無菌離心管中，5000 r/ min 離心5min；菌體沉淀用侵染培養基洗滌一次后，再用該培養基重懸，使重懸菌液OD600 = 0.3～1.0 。重懸菌液中加入終濃度為200 μmol/L的AS，用于侵染大麥外植體。

1.2.4 大麥幼胚的侵染和共培養。將轉化受體浸入侵染培養基(表1),在24±1℃條件下分別用OD600為0.3，0.6，1.0的菌液分別侵染15min、30min、1h ,用滅菌濾紙吸干后直接轉移到共培養基，于 24±1 ℃，暗培養 2～3d。

1.2.5 抗性愈傷組織的誘導和選擇。共培養洗菌后的愈傷組織置于誘導培養基24±1 ℃黑暗培養下恢復培養5～7d，然后將愈傷組織轉入附加50 mg/L Hyg的誘導培養基上, 同樣的條件下培養2～4周，篩選出抗性愈傷組織。之后轉入附加25 mg/L Hyg的分化培養基進行24±1 ℃，16h/8h (光/暗) 光照培養，以篩選抗性芽、苗。

1.2.6 gus檢測。gus 活性的組織化學染色檢測，按 Jefferson 的方法[15]進行。共培養后將幼胚或愈傷組織浸泡在1mM的X-Gluc溶液中，37℃下24h，然后換入70%酒精中保存，肉眼或顯微鏡下觀察gus基因表達情況。

X-Gluc染色液配方中包括38ml 0.2mol/L NaH2PO4, 62ml 0.2 mol/L Na2HPO4, 1ml 0.1 mol/L K3[Fe(CN)6], 1ml 0.1 mol/L K4[Fe(CN)6], 4ml 0.5 mol/L Na2EDTA, 200mg X-Gluc, 50ml 甲醇和120ul Triton-X，定容到250 ml。

gus瞬時表達率 = gus瞬間表達受體組織數/感染總受體組織數 ×100 %。

2 結果與分析

2.1 不同預培養天數對大麥幼胚根癌農桿菌遺傳轉化的影響

影響T-DNA的轉移的因素之一在于幼胚轉化前的預培養。預培養時間即介于幼胚剝離培養和農桿菌侵染幼胚的時間段。在以往研究[7]基礎上，筆者主要選擇預培養1d，及4～6d的幼胚作為受體材料進行比較。經根癌農桿菌侵染后取部分材料進行gus瞬時表達檢測。在預培養 1 d 的幼胚和預培養 4～6 d的幼胚愈傷組織中均能檢測到 gus瞬時表達(圖1A,B)，但是隨著預培養天數的增加，gus基因的瞬時表達率顯著下降(表2)。相對于預培養4～6d的幼胚，預培養1d的幼胚gus瞬時表達藍點在盾片的分布區域更廣。因此，后續實驗選用預培養1d的幼胚用于農桿菌侵染。

表2 不同預培養天數幼胚的 gus瞬時表達結果

2.2 侵染時間及菌液濃度對大麥幼胚根癌農桿菌遺傳轉化的影響

以農桿菌菌株C58c1/pVec-8-gus感染經預培養后的轉化受體，分別設計了幾種不同的菌液濃度及侵染時間，比較它們對抗性愈傷組織形成的影響(表3，表4)。由表3結果可以看出OD600 =0.5時幼胚抗性愈傷組織獲得率最高，達22%，遠高于0.3和1.0。且隨著菌液濃度增大，得到的抗性愈傷組織相對較少。

表3 農桿菌菌液濃度對大麥抗性愈傷組織形成的影響

農桿菌吸附在細胞表面是T-DNA轉移及整合的前提。因此，轉化受體在菌液中浸泡的時間對轉化率也有一定的影響。由表4 結果可以看出農桿菌侵染時間為30min時，獲得的抗性愈傷組織相對較多。隨著侵染時間的延長，存活的幼胚數減少，從而抗性愈傷組織獲得率明顯下降。

表4 侵染時間對大麥抗性愈傷組織形成的影響

2.3 共培養對大麥幼胚根癌農桿菌遺傳轉化的影響

轉化受體與農桿菌的共培養是農桿菌附著和整合到植物細胞的階段，共培養成功與否是轉化的關鍵。侵染后的大麥幼胚于固體培養基或液體培養基共培養3d，共培養結束后挑取幼胚或愈傷組織進行gus瞬時表達檢測，并比較共培養基中添加半胱氨酸和乙酰丁香酮對轉化的影響(表5)。結果顯示，不同農桿菌侵染大麥幼胚后，液體共培養及固體共培養gus瞬時表達率平均值分別為90%，27%。

表5 共培養對轉化效率的影響

注：ASa， 500 uM 乙酰丁香酮； Cysb，800 mg/L半胱氨酸。

半胱氨酸等抗氧化物質可以減弱農桿菌侵染后對幼胚造成的組織壞死和細胞死亡，在液體共培養基中添加了800mg/L 半胱氨酸，結果幼胚表面的褐化顯著減少，而且轉化效率也相對較高。此外，在共培養基中還添加了500uM乙酰丁香酮(AS)。由于該物質可以誘發農桿菌的轉化活力，最終使gus瞬時表達率達到80%。

2.4 高毒力菌株及優良受體基因型的篩選

取Golden Promise,秀81-47，schooner,甘啤4號幼胚愈傷組織作為轉化受體，共培養3d后隨機挑取受體組織進行組織化學染色，測定gus瞬時表達結果(表6)。從中可看出各菌株的轉化結果明顯不同，說明不同菌株對轉化效果有顯著影響。其中EHA105 gus瞬時表達率為52.4%，而C58c1僅為37.3%，相對于C58c1，EHA105為高毒力菌株。

表6 不同菌株轉化大麥幼胚愈傷組織的gus瞬時表達結果

本實驗用4個大麥品種幼胚或愈傷組織作受體，用農桿菌C58c1,EHA105分別轉化結果見表7。 結果表明，不同受體基因型對農桿菌的敏感性各不相同。其中，Schooner和Golden Promise的gus 瞬時表達率均較高，分別為58.3%，56.3%，但是這兩個品種均為模式品種，因此在后續實驗中還是采用秀81-47和甘啤4號進行遺傳轉化。

表7 農桿菌EHA105、C58c1在不同受體基因型中的gus瞬時表達結果

2.5 抗性愈傷組織的篩選

共培養后將愈傷組織轉移到恢復培養基上(未添加選擇壓)過渡培養7～14d，愈傷組織生長得到恢復，然后轉移到含Hyg 50mg/L的選擇培養基上進行第一步篩選，15d左右出現較多的胚性愈傷組織(圖1C,D)。胚性愈傷組織轉移到第2次選擇培養基(Hyg 25mg/L)，約5～7d產生抗性芽(圖1E,F)，同時部分假抗性愈傷組織開始死亡。抗性再生芽再次轉移到第2次選擇培養基約5～10d，假抗性再生芽逐漸萎縮死亡，同時在Hyg作用下未轉化愈傷組織分化形成白苗(圖1G,H)。各品種抗性愈傷組織形成見表8。

表8 不同受體基因型大麥抗性愈傷組織形成情況

抗性愈傷組織誘導率為11.2%～58.4%，5種基因型大麥轉化30d后獲得的抗性愈傷組織占受體總數的34.2%。但是該指標在不同基因型之間存在較大差異，schooner為58.4%，明顯高于GP。甘啤4號獲得的抗性愈傷組織較多，抗性愈傷組織誘導率為46.4%，明顯高于秀81-47和秀麥1號。

3 討論

大麥以幼胚為外植體進行遺傳轉化的報道不少[1-4，7-8]，但是基因型依賴、轉化后再生苗分化頻率低的問題仍得不到很好的解決。本試驗研究了影響轉化的重要因素，并進行了因素優化，初步建立了可用于大麥幼胚的根癌農桿菌轉化系統。

在禾谷類作物的遺傳轉化中幼胚是首選的轉化受體，主要是幼胚具有良好的分化和再生能力。有研究表明幼胚經農桿菌侵染10～15min將會降低新鮮剝離幼胚的存活率，而進行了預培養處理的幼胚經侵染后能更好地恢復培養[7]。本研究中預培養1d的幼胚不僅能耐受30min的侵染，而且在盾片區域能形成更多數量的藍點，這與 Shrawat等的研究結論一致。此外，Shrawat等在預培養5d的幼胚中沒有檢測到gus表達，但是在本實驗中預培養4～6d的幼胚均有gus藍點分布。這可能是外植體來源差異使得轉化受體的感受狀態有所不同造成的[16]。因此，通過優化幼胚預培養時間可促進T-DNA轉移到幼胚再生能力較強的區域，從而提高轉化效率。

本研究所選用的農桿菌和轉化受體采用液體共培養的方式，提高了轉化效率。相對于固體共培養，液體共培養后幼胚gus瞬時表達率較高，這與Hensel[1]等研究結果一致。此外，此方法還能夠轉化時一次處理較多的受體組織，有效提高工作效率。盡管采用固體共培養獲得的抗性愈傷組織比液體共培養稍多,但是鑒于實際操作的便利性，液體共培養是值得推薦的共培養方法。

進行穩定的大麥遺傳轉化與所采用的農桿菌菌株有關[17]。大麥幼胚的基因轉移一般采用AGL菌系，如AGL0或AGL1[3,18]。本研究中，C58c1是小麥轉化中常用的菌株[19]，EHA105多數用于單子葉植物的遺傳轉化。通過用這兩種農桿菌對大麥不同基因型進行轉化，從gus表達的結果來看，不同農桿菌的致毒力有所不同，盡管兩種菌株均有gus表達，但是EHA105相對C58c1表現更為突出。此外，在后續實驗中將繼續進行AGL1農桿菌的侵染力比較實驗。

本研究在共培養基中添加了半胱氨酸和AS以改進培養方法。Olhoft 和Somers[20]首次提出半胱氨酸對經農桿菌侵染后大豆子葉節細胞的壞死反應有正向促進作用。主要是由于這種氨基酸的抗氧化作用使得農桿菌侵染后外植體的防御反應有所減弱。本研究結果也證實了這一觀點。因為在添加800 mg/L 半胱氨酸后，侵染后的幼胚不但沒有出現組織壞死和細胞凋亡，而且添加了半胱氨酸后轉化效率相對較高。

該方法的另一改進在于AS的應用。眾所周知，AS作為誘導物能被農桿菌識別并且在T-DNA轉移過程中起重要作用。它能誘導細菌向植物組織傷口的趨向運動并到達感受態細胞完成基因轉移，而且還能激活Vir區基因。本研究通過在共培養基中添加500 uM AS使得轉化效率顯著提高(表5)。與早期用幼胚進行遺傳轉化的有關報道相比，本實驗中AS的濃度相對較高，Kumlehn[21]等應用大麥花藥進行遺傳轉化時AS濃度也為500 uM。

供體材料的遺傳背景是影響植物遺傳轉化的另一重要因素。對某些特定種質資源如生長區域不同或擁有某種特殊感病或抗性的育種品系和品種進行穩定的遺傳轉化是更為必要的。Murray[6]等報道獲得Golden Promise 和3個澳大利亞品系的轉基因株系。來自德國的 “Igri”是目前采用農桿菌介導的遺傳轉化成功獲得轉基因植株的唯一冬性大麥品種。本研究發現春性大麥品種甘啤4號和秀81-47是對農桿菌較為敏感的基因型，抗性愈傷組織獲得率分別為46.4%，38.3%，甘啤4號是甘肅省大面積推廣的啤酒大麥優良品種，秀81-47是組培特性優良的大麥品種，若以這兩個大麥品種進行遺傳轉化，有望獲得品質加以改良的大麥轉基因株系。

圖1 大麥幼胚根癌農桿菌轉化后gus表達、抗性愈傷組織形成及抗性芽分化

注：A、B：預培養不同天數幼胚及愈傷組織gus瞬時表達情況；C、D：50mg/L Hyg選擇壓形成的抗性愈傷組織；E、F：25mg/L Hyg 選擇壓形成的抗性芽；G、H： 25mg/L Hyg 選擇壓篩選出的非轉化白苗。

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