正交實驗聯用星點設計-效應面法優化紫草素脂質體處方

邢建國，王新春，張永軍，袁勇，蒲宇紅

(1.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆烏魯木齊830004;2.新疆石河子大學一附院，新疆石河子832008;3.新疆石河子大學藥學院，新疆石河子832008)

新疆軟紫草為紫草科多年生草本植物，具有多種生物學作用［1-2］。紫草素為紫草中脂溶性很強的萘醌類色素，具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥［3］和廣泛的抗腫瘤作用［4］，但紫草素水溶性差的性質影響了其在醫藥領域的廣泛應用。脂質體作為難溶于水的藥物輸送載體具有許多優越性，其所具有的生物膜特性可將難溶藥物包埋于脂質體雙分子層所形成疏水腔內，使得藥物粒子溶解度增大，促進被包裹的難吸收性的藥物在腸道的傳遞，提高其生物利用度。

在脂質體處方優化中，常需考察多個因素的多個水平，因此，尋找一種實驗次數少、而實驗結果接近全面實驗優化出的結果的實驗設計方法是每位研究者十分關心的問題。正交設計［5］、均勻設計［6］和星點設計－效應面優化法［7］是常采用的試驗設計方法。其中正交實驗設計安排的實驗具有均衡搭配的特點，但其所建立的指標和因素之間關系的數學模型是一種線性模型，因此模型的精度不夠、預測性較差。星點設計－效應面優化法是一種多元非線性擬合的實驗設計方法，所建立的非線性數學模型精度高、預測性較好。但若需考察的因素較多時，則存在實驗次數偏高的不足，如五因素則需52次試驗。因此，基于正交設計和均勻設計聯用的研究［8］結合正交設計與星點設計兩種設計方法的各自特點，在進行紫草素脂質體處方優化過程中，首先采用正交實驗設計試驗次數較少的特點，進行多因素的初步篩選，再將所確定的主要影響因素采用預測精度較高的星點設計非線性數學模型進行優化，旨在達到利用較少的試驗次數得到具有較高預測精度的數學模型的研究目的，進而保證紫草素脂質體的處方優化的準確性。

1 藥物、試劑和儀器

紫草素(青島市海大化工有限公司);大豆磷脂(上海太偉藥業有限公司，批號070614，含量90%);膽固醇(上海生物化學試劑公司，批號051023);乙醇、曲拉通等試劑為分析純。

SPD-10ATVP液相色譜儀(日本島津);85-2A數顯式磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇市榮華實驗儀器廠);電子分析天平(德國賽多利斯Sartorius);BP211D臺式離心機TGL-16G(上海安亭科學儀器廠);KQ-250B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);90plus激光粒度分析儀(美國Brookhaven);SAS統計軟件(Release 8.20，SAS Institute Inc.);Origin6.0繪圖軟件(Microcal Software Inc.)。

2 方法與結果

2.1 紫草素脂質體的制備［8］

結合實驗室條件及預試驗研究結果，采用乙醇注入法制備紫草素脂質體。分別取處方量的大豆磷脂、膽固醇、紫草素于棕色瓶中，精密稱定。加入適量無水乙醇，超聲使完全溶解。在600 r/min機械攪拌條件下，將所得的乙醇混合物溶液注入到含甘露醇的水性溶液中，室溫攪拌5 min，得到脂質體膠體分散液。

2.2 載藥量和包封率的測定

紫草素脂質體中紫草素的含量用高效液相色譜法測定。色譜柱:AgilentXDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:甲醇-0.025 mol/L磷酸(78∶22);柱溫:25℃;流速:1.0 mL/min;測定波長:516 nm，進樣量20 μL。載藥脂質體和游離藥物采反相透析法分離。含藥脂質體0.5%曲拉通乙醇溶液超聲10 min進行消解。高效液相色譜法檢測，每批樣品測定3次計算藥物包封率和載藥量。

2.3 納米粒粒徑及分布的測定方法［9］

待測樣品的平均粒徑及粒度分布用90plus激光粒度分析儀測定。

2.4 實驗設計

按L8(27)安排實驗，依據文獻及預實驗結果初步考察藥物與脂質比(X1)、大豆磷脂濃度(X2)、有機相和水相體積比(X3)、大豆磷脂與膽固醇比(X4)、甘露醇濃度(X5)5種影響因素，以包封率(EE%)、載藥量(DL%)及歸一化值為指標，對數據進行直觀分析及方差分析，確定主要影響因素。因素-水平表見表1。

表1 L8(27)正交實驗因素-水平表

依據正交實驗設計篩選結果，按三因素五水平星點設計安排實驗，進一步考察影響處方配比的主要因素X1、X3及X4對包封率、載藥量及歸一化值(OD)三個評價指標的影響，依據三次多項式非線性回歸方程及效應面法確定紫草素脂質體處方的最佳配比。因素-水平表，見表2。

表2 星點實驗設計因素水平表

2.5 數據處理與結果分析

2.5.1 正交實驗結果處理

采用正交設計助手v3.1軟件，綜合考慮各因素對包封率、載藥量及歸一值的影響，確定主要影響因素為大豆磷脂濃度、藥脂比和有機相-水相體積比。次要因素進一步確定為甘露醇濃度2%、大豆磷脂與膽固醇比4∶1。試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果

2.5.2星點設計模型擬合

用SAS8.0統計軟件，以各評價指標(因變量)分別對各因素(自變量)選擇3種數學模型進行曲線擬合。模型如下:

多元線性方程:D=b0+b1x1+b2x2+b3x3

二次多項式:D=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x1x2+b5x1x3+b6+b7x2x3+b8+b9

三次多項式:

D=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x1x2+b5x1x3+b6+b7x2x3+b8x22+b9x23+b10+b11x1+b133+b14x2

三個指標的多元線性回歸方程結果顯示，盡管模型可以通過檢驗，但模型擬合的相關度不佳，因此應采用多元高次的數學模型。三個指標二次多項式回歸方程的擬合結果是，各項系數的估計值多數不能通過P<0.2的檢驗，一定程度的簡化后仍不能通過P<0.1的檢驗;三次多項式方程的擬合結果則各項系數在刪除P>0.2的項后，進行t檢驗，三個指標的方程均通過P<0.005的檢驗，模型擬合優度好。

三個指標的三次多項式方程如下:

y1=172.193+25.881X1－533.374X2－25.586X3－196.211X1X2－0.254X1X3+139.156X2X3+0.489X3X3+367.979X1X2X2－135.832X2X2X3－1.585X2X3X3R=0.991 0

y2=－1.643+3.247X1－0.792X3－17.069X1X2－0.107X1X1+6.087X2X3+0.285X1X1X2+25.296X1X2X2－9.875X2X2X3R=0.974 5

y3=－0.163+0.767X1－0.216X3－3.965X1X2－0.035 0X1X1+1.274X2X3+0.001 54X3X3+0.100X1X1X2+5.447X1X2X2－2.010X2X2X3R=0.987 6

上述結果顯示，包封率、載藥量和歸一化值三指標的三項式擬合均比線性模型相關系數高。

2.6 優化工藝

固定3個自變量中影響較弱者，設為中值，代入原方程，應用Origin6.0軟件分別繪制各指標與影響較顯著的2個自變量的三維效應面和二維等高圖。從三維效應面圖和等高圖中，選取包封率和載藥量較高及綜合指標較理想的區域，求其相應的自變量范圍，得較優處方為X1=8%，X2=0.45%，X3=20。根據優化處方平行制備3份樣品，所得脂質體的包封率、載藥量分別為85.4%，載藥量為5.16%，偏差的絕對值均小于5%，平均粒徑為98.1 nm、多分散指數為0 203，說明模型預測性好。

3 討論

3.1 用線性數學模型進行擬合的正交實驗方法是一種實驗次數少、預測性精度不高的方法;星點設計是一種非線性數學模型擬合的實驗設計方法，是根據模型所建立的效應面的區域進行篩選，具有預測精度高的特點，但考察因素多時，實驗次數也較多。本實驗將兩者有機地結合，采用正交實驗，通過較少的實驗次數確定主要影響因素，在此基礎上采用星點設計進一步優化，對實驗數據進行模型預測。驗證實驗結果表明，兩個方法的聯用不僅提高了實驗效率，而且使預測結果具有較高的準確性。因此，是一種簡便、可行及可靠的實驗設計方法，尤其更適用于影響因素較多的實驗。

3.2 目前微粒給藥系統中用于藥物包封率測定的方法有超速離心法、離心超濾法、柱分離法等。本實驗依據文獻［10］建立了反相透析法測定藥物包封率的方法，同時對各方法進行比較研究，結果表明，該方法與上述方法相比，具有經濟、簡便和準確的特點，是一種用于處方和工藝篩較為理想、可靠的方法。

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