生地黃中梓醇純化工藝優選

楊 菁， 劉 影， 白 劍， 樊 淼， 安 陽， 岳春麗

（遼寧醫學院細胞生物學及新藥開發重點試驗室，遼寧錦州 121001）

生地黃中梓醇純化工藝優選

楊 菁， 劉 影， 白 劍， 樊 淼， 安 陽， 岳春麗

（遼寧醫學院細胞生物學及新藥開發重點試驗室，遼寧錦州 121001）

目的：探討生地黃中梓醇的最佳純化工藝。方法：采用高效液相色譜法檢測梓醇含量。以梓醇含量為指標，比較不同型號的大孔樹脂、活性炭對梓醇的分離效果，再對所含梓醇的部分應用不同的葡聚糖凝膠進行分離。結果：優選確定的工藝為：用15%活性炭對梓醇粗提物吸附后，活性炭用20%乙醇洗脫，將收集洗脫液濃縮后用葡聚糖凝膠G-15進行分離，所得產物中梓醇含量在85%以上。結論：優化確定的梓醇化化工藝簡單可行。

生地黃；梓醇；G-15；HPLC

生地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）的干燥塊根，臨床應用廣泛，具有滋陰補血、生津的功效。環烯醚萜苷類是生地黃的主要活性部位，其中梓醇含量最高?，F代研究證明梓醇具有降血糖［1］、保護缺血再灌注受損神經元［2］、抗癌［3］等藥理活性。但梓醇化學性質不穩定，易受酸堿［4］等條件影響，這為梓醇的純化增加了難度，本文在地黃中梓醇提取工藝條件優化的基礎上［5］，應用活性炭及葡聚糖凝膠對地黃醇提取物進行分離，以期獲得純度較高的梓醇。

1 儀器與試藥

LC-10 Avp高效液液相色譜儀，日本島津公司生產。KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器公司生產。A240型電子天平，美國梅特勒公司生產。恒溫水浴箱 ，北京市永光醫療儀器廠。生地黃，產自河南省武涉縣西陶鎮，按照2005年版《中國藥典》一部地黃質量標準檢驗，符合規定。梓醇對照品，批號110808-200407，購于中國藥品生物制品檢定所。HC-767型活性炭，杭州木材有限公司活性炭公司。大孔樹脂，天津南開化工廠生產；葡聚糖凝膠，美國GE公司。乙腈，美國Fish公司生產。其余試劑為國產分析純。

2 試驗方法

2.1 梓醇的含量測定［6］色譜柱：日本島津VP-ODS柱，4.6 mm×150 mm；流動相：乙腈：0.1%磷酸（1∶99）；流速：0.9 mL/min；柱溫：36℃ ；檢測波長：214 nm。

對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的梓醇對照品5.0 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液備用。

供試品溶液的制備 取供試品適量，加水至5 mL，制備成每1 mL含梓醇濃度約為每0.5 mg的溶液，用0.45 μm濾膜濾過，取續濾液即得。

測定法 分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2 梓醇粗提物的制備［5］取生地黃500 g適當粉碎，加入12倍量95%乙醇，回流提取1 h，濾過，得濾液1；藥渣中加入10倍量95%乙醇，回流提取1 h，濾過，得濾液2，合并兩次濾液，減壓濃縮至500 mL，過濾，得地黃醇提物備用。批號：C20080301、C20080302、C20080303，梓醇濃度分別為3.18、3.16、3.19 mg/mL。

2.3 梓醇的分離純化

2.3.1 活性炭對梓醇的吸附 活性炭的預處理取活性炭粉末100 g置105℃烘箱內加熱3 h。放至室溫后備用。

活性炭的吸附能力計算 量取100 mL樣品，向其中加入15 g粉末狀活性炭，攪拌，靜置2 h，濾過，收集濾液，高效液相分別檢測濾液和活性炭吸附前藥液中梓醇含量。結果見表1。

實驗結果可知，活性炭對梓醇具有較強的吸附能力，平均吸附量為19.9 mg/g。

2.3.2 梓醇的洗脫 根據活性炭特點，選擇不同濃度的乙醇及水對活性炭進行洗脫。

表1 活性炭的吸附量

取200 mL樣品，向其中加入30 g活性炭，攪拌，靜置2 h，濾過，收集活性炭陰干，用1 000 mL水、1 000 mL 10%乙醇、1 000 mL 20%乙醇、1 000 mL 40%乙醇、1 000 mL 95%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，減壓濃縮至體積為200 mL，薄層跟蹤檢測，實驗結果見表2、表3。

表2 不同濃度乙醇對梓醇洗脫薄層結果

表3 活性炭洗脫后梓醇的純度和收率

實驗結果提示10%～20%乙醇洗脫效果較好，收率在80%左右，梓醇純度約為45%，采用活性炭吸附可作為梓醇的粗分離手段。

2.3.3 梓醇的進一步分離純化 由于活性炭洗脫液中梓醇含量在45%左右，需對其進一步純化，參考相關文獻，本實驗選取3種型號的葡聚糖凝膠分別考察對梓醇的分離情況。

葡聚糖凝膠的預處理在室溫條件下，分別將將100 g葡聚糖凝膠G-15、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠LH20用5倍體積的純化水溶脹4 h，漂洗3次去除破損的膠粒，加入適量的純化水充分混勻將凝膠灌入玻璃色譜柱，靜置，使其充分沉降后，用純化水平衡后，打開活塞放出多于的水，使液面略高于膠面時關閉活塞，待上樣，徑高比為1∶8。

樣品的制備 取生地黃醇提液100 mL，用活性炭吸附，先用水洗脫1 000 mL，再用20%乙醇分別洗脫2 000 mL，收集20%乙醇洗脫液，減壓濃縮至100 mL備用。

樣品的分離 取10 mL樣品，分別緩慢加到葡聚糖凝膠G-15、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠LH20凝膠柱中，打開活塞，當藥液面接近膠面時加水洗脫，采用部分自動收集器進行收集，流速為0.5 mL/min，每10 min收集一管。薄層跟蹤檢測梓醇。

通過薄層跟蹤對3種不同型號的葡聚糖凝膠對梓醇的分離效果進行比較，由試驗結果可見葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠LH20對梓醇的分離效果不理想，而葡聚糖凝膠G-15能將梓醇與其他成分實現較好的分離。

2.3.4 梓醇分離純化驗證試驗 根據以上試驗結果，采用活性炭吸附、20%乙醇洗脫及G15分離的方法，對梓醇粗提物進行了分離純化。實驗結果見表4。

表4 重復性試驗結果

從表4可見，工藝進行重復性試驗結果收率能夠達到50%以上，梓醇純度能夠達到85%。

3 討論

本實驗在前期實驗獲得的梓醇粗提物［5］的基礎上，首先比較了梓醇的粗提物在不同型號分別對D101、AB-8、S-5、NKA-9 四種型號大孔樹脂考察吸附量和分離效果，其中只有大孔樹脂D101對梓醇的分離效果較好，吸附量在1.002 mg/g干樹脂，但也不能充分分離梓醇與糖類?；钚蕴繉﹁鞔嫉奈搅繛?9 mg/g，其吸附量大于大孔樹脂，分離效果與大孔樹脂相同。由于活性炭操作簡單，因此選用活性炭對梓醇進行分離，梓醇的收率約為80%，純度在45%左右。

活性碳處理后，選用不同型號的葡聚糖凝膠對梓醇進行分離，結果表明葡聚糖凝膠G-15分離效果好，收率高達50%以上，純度能達到85%以上。

［1］萬昌武，張雅麗，桂華珍，等，地黃不同方法提取物制劑降糖作用的實驗研究［J］，貴州醫藥，2003，27（12）：1112-1113.

［2］李 楊，李丹清，包永明，等，梓醇對缺血再灌注受損傷神經元保護作用的研究［J］.中國現代醫學雜志2005，15（10）：1454-1460.

［3］Pungitore C R，AyubM J，Borkowski E J，et al.Inhibition of Taq DNA polymerase by catalpol［J］.Cell Mol Biol，2004，50（6）：767.

［4］王宏潔，邊寶林，楊 健.地黃中梓醇變化條件的探討［J］.中國中藥雜志，1997，22（7）：408.

［5］劉 影，楊 菁，黃 雷，等.正交實驗法優選地黃中梓醇的提取工藝［J］.時珍國醫國藥，2009，20（1）：157-159.

［6］中國藥典［S］.一部，2005：82.

R284.2

A

1001-1528（2010）03-0416-03

2009-04-14

遼寧省自然科學基金（20072202）；遼寧省教育廳資助課題（20060528）；遼寧省教育廳創新團隊課題（2008T115）

楊 菁（1968－），男，副教授，博士，碩士生導師，從事腦血管疾病機制及相關藥物研究。Tel：（0416）4673465 E-mail：jzyangjing@gmail.com