殼聚糖用于五苓滴丸澄清工藝的考察

金 巖,張 宇,李三鳴

五苓滴丸是本實驗室擬研制的新劑型,其組方基礎(chǔ)是“五苓散”。“五苓散”系漢代著名醫(yī)家張仲景所創(chuàng)的名方成藥之一,見于《傷寒論》,是利水滲濕的代表方。其組成為澤瀉、茯苓、豬苓、白術(shù)、桂枝共 5味藥物。其功用為通陽化水、健脾利水,對泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝疾病、運動骨骼系統(tǒng)疾病均有一定的治療作用[1]。五苓水煎劑的澄清工藝未見報道。本文利用殼聚糖絮凝劑,對五苓水煎液進行澄清,選擇干浸膏收率、總多糖含量為指標進行考察,并與醇沉法比較,篩選出最佳澄清工藝條件,為制備五苓滴丸新劑型提供可靠的依據(jù)。

1 儀器與試藥

賽多利斯電子天平 CPA225D(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司),TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。澤瀉、茯苓、豬苓、白術(shù)、桂枝(均購自遼寧正大醫(yī)藥有限公司),殼聚糖(脫乙酰度 90%,浙江金殼生物化學(xué)有限公司),葡萄糖對照品 (中國藥品生物制品檢定所),蒽酮(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心),乙腈、甲醇為色譜純,水為重蒸水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 五苓滴丸的處方 澤瀉 150g,茯苓 90g,豬苓 90g,白術(shù) 90g,桂枝 60g。

2.2 制備工藝 稱取澤瀉 150g,乙醇提取后取藥渣揮干乙醇備用;按處方量分別稱取茯苓、豬苓、白術(shù)、桂枝 4味藥,與澤瀉藥渣合并,用 6倍量的水提取 3次,每次 1.0h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至藥材與藥液比為 1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1共 5個濃度藥液備用。

2.3 干浸膏收率的測定 精密移取提取液 5mL,置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,于 105℃干燥至恒重,移置干燥器中,放置 30m in,迅速稱定重量,并計算干浸膏收率(W/W)。

注:E為干浸膏收率,Wd和Wt分別表示干浸膏量和總藥材量

2.4 葡萄糖含量的測定

2.4.1 蒽酮硫酸試液的配制 稱取蒽酮 0.200 4 g,置于錐形瓶中,加入濃硫酸 100mL,使溶解,即得。臨用新配。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取葡萄糖對照品 0.052 0g,置于 100mL容量瓶中,加蒸餾水溶解,并稀釋至刻度,搖勻,得 520.0μg/mL的葡萄糖對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取五苓水煎液適量, 5 000r/m in離心 10m in,精密移取上清液 1mL,加水稀釋定容至一定體積,搖勻,得供試品溶液。2.4.4 葡萄糖標準曲線的繪制 分別精密吸取葡萄糖對照品溶液 0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL于 10mL具塞試管中,用水補充到 1mL,置冰水浴中,分別迅速加入新配制的蒽酮硫酸試液4mL,各管加完后一起浸入沸水浴中煮沸 10m in,自來水迅速冷卻并放至室溫。以空白溶液為對照,在625nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度(C)為橫坐標、吸光度 (A)為縱坐標進行線性回歸,得標準曲線:A=6.101 7C +0.065 8,r= 0.999 0。結(jié)果表明,葡萄糖在 10.4～104.0μg/ mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.4.5 測定方法 精密吸取對照品溶液、供試品溶液各 1mL于具塞試管中,置冰水浴中,迅速加入新配制的蒽酮硫酸試液 4mL,按照“2.4.4”項下方法測定。

2.5 殼聚糖澄清工藝的考察 殼聚糖絮凝工藝的優(yōu)化:本試驗采用天然絮凝劑對藥液進行精制,以總多糖含量和干浸膏收率為指標,對五苓散提取液精制方法進行考察。

2.5.1 絮凝劑溶液的制備 殼聚糖溶液的配制:取殼聚糖適量,加 1%醋酸制成 1%(w/v)的溶液。

2.5.2 單因素考察 ①絮凝溫度:取6支試管,各加入 30mL藥材提取液(1∶2),加入殼聚糖溶液各3mL,搖勻,分別在室溫及 30、40、50、60、70℃下保持恒溫 30m in,于 4℃冰箱中靜置過夜,觀察澄明效果。結(jié)果顯示,殼聚糖溶液于 40℃對提取液的絮凝效果最好。②攪拌強度:取 4個燒杯,各加入 30mL藥材提取液(1∶2),加入殼聚糖溶液各 3 mL,40℃下分別置于 0、50、100、150r/m in磁力攪拌器中,攪拌 10m in,于 4℃冰箱中靜置過夜,觀察其絮凝效果。結(jié)果顯示,殼聚糖溶液于 50r/m in時,對提取液絮凝效果最好。③攪拌時間:取 4個燒杯,各加入 30mL藥材提取液 (1∶2),加入殼聚糖絮凝劑,條件如前述優(yōu)化結(jié)果,分別攪拌 0、5、10、15m in,于 4℃冰箱中靜置過夜,觀察其絮凝效果。結(jié)果顯示,攪拌 10m in對提取液絮凝效果最好。④絮凝藥液濃度的選擇:5個濃度的藥材濃縮液各取 30mL,按表 1加入 1%的殼聚糖溶液,40℃下,以50r/m in攪拌 10m in,于 4℃冰箱中靜置過夜,觀察其絮凝效果。見表 1。

實驗表明,殼聚糖澄清劑在藥液中的加入量與藥液所含的藥材量有關(guān),且隨著藥液的密度增加,需加入的殼聚糖量有增大的趨勢。藥液經(jīng)過殼聚糖絮凝后,絮體狀態(tài)會影響生產(chǎn)效率。絮體呈松絮狀,沉淀易于過濾;絮體呈緊絮狀,則過濾難,勢必增加生產(chǎn)周期。所以選擇松絮狀的絮體。

表1 不同藥液濃度的澄清試驗結(jié)果

當(dāng)藥材與藥液濃縮比為 1∶4時,絮體為松絮狀,上層液的澄清度較好。當(dāng)絮凝溫度、藥液濃縮比例、攪拌時間和強度固定后,絮凝劑的加入量則成為影響澄清度的最主要因素。

⑤絮凝劑用量的考察:由表 1可見,當(dāng)藥材與藥液濃縮比為1∶4,殼聚糖加入量為3～9 mL,此時絮凝效果好,上層液體澄清。取 11個燒杯各加入50 mL藥材提取液 (1∶4),按表 2加入不同體積的1%殼聚糖絮凝液。40℃下,以 50 r/min攪拌 10 min,處理后轉(zhuǎn)移至 50 mL比色管中,于 4℃冰箱中靜置過夜,觀察其絮凝效果。取上層液分別測總多糖含量和干浸膏收率,結(jié)果見表 2。

表2 殼聚糖絮凝結(jié)果

由表 2可見,殼聚糖用量對澄清效果影響較大,隨著絮凝劑加入量增大,藥液由渾濁變澄清,當(dāng)殼聚糖的量超過一定值時,藥液又從澄清狀態(tài)逐漸變?yōu)闇啙?同時,藥液中有效成分含量也隨之降低,干浸膏收率下降。從上層液澄清度來看,加入量從 8～13 mL都在澄清范圍內(nèi),其中 6號加入量為 10 mL時,總多糖含量最高。而從干浸膏收率來看,4號加入量為 8 mL時最高,但其總多糖含量較低。比較兩者的收率相差不大,故綜合考慮,殼聚糖絮凝劑的加入量為 10 mL為宜,即每 100 mL藥液,殼聚糖的用量為0.2 g,100 g藥材加入殼聚糖 0.8 g。

2.6 殼聚糖絮凝法與醇沉法工藝比較 取藥材提取液(1∶4)共 2份,1份按照殼聚糖最佳澄清工藝精制藥液;另 1份緩緩加入 95%乙醇,邊加邊快速攪拌,使藥液最終含醇量達到 80%。將 2份藥液于 4℃冰箱中靜置過夜。分別取藥材原提取液(1∶4)、殼聚糖絮凝法和醇沉法精制后的藥液,測定總多糖含量及干浸膏收率。見表 3。

表3 殼聚糖絮凝法與醇沉法的比較

由表 3可知,2種澄清方法處理后的藥液上層液都很澄清,干浸膏收率相差不多。與藥材原提取液相比,2種澄清方法對干浸膏收率有顯著性影響。在除去雜質(zhì)的同時,活性成分總多糖的保留率上,殼聚糖絮凝法明顯優(yōu)于乙醇沉淀法。所以,選擇殼聚糖絮凝法作為藥材提取液的最終精制方法,藥材與藥液的濃縮比例為 1∶4,殼聚糖最佳用量為 0.8%(g/g),于 40℃下,以50 r/min的速度,攪拌 10 min,靜置過夜,濾過,即得。

3 討論

3.1 殼聚糖是一種天然吸附澄清劑,是僅次于纖維素的第二大多糖,屬天然陽離子絮凝劑,無毒無味,可生物降解,不會造成二次污染。其分子結(jié)構(gòu)與纖維素相似,當(dāng)溶解于稀酸溶液中時,可與藥液中帶負電荷的纖維素單寧、粘液質(zhì)等雜質(zhì)以及帶負電荷的細菌結(jié)合,形成沉淀而被除去,達到澄清的目的。殼聚糖是甲殼素 (Chitin)的部分脫乙酰產(chǎn)物,來源極其豐富,廣泛存在于蟹、蝦等低等動物以及藻類、真菌等植物中,隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展,沿海地區(qū)海產(chǎn)品加工廠廢棄的蝦蟹等的數(shù)量巨大,所以殼聚糖的成本非常低,并且應(yīng)用方便,長期口服無明顯毒副作用,使用安全[2]。

3.2 實驗中發(fā)現(xiàn),藥液密度高,導(dǎo)致殼聚糖加入量增加,成本增加。殼聚糖加入量過低達不到澄清效果,過高會使絮凝惡化,藥液又由澄清狀態(tài)重回混濁狀態(tài),所以,嚴格掌握殼聚糖的加入量,才能達到理想的澄清效果。實驗中殼聚糖絮凝劑和蒽酮硫酸試液都要臨用新配。

3.3 衡量藥液澄清效果的重要標志是藥液中有效成分的保留率高、澄清速度快、生產(chǎn)周期短。五苓滴丸中 4味藥皆含有多糖,后者是重要的藥理活性成分[3]。殼聚糖絮凝法對藥液中的多糖保留率高,與文獻[4]報道一致。而傳統(tǒng)的醇沉除雜法澄清時間較長。據(jù)報道,醇沉法造成了有效成分的大量流失,尤其是對免疫有重要調(diào)節(jié)作用的多糖易被除去[5]。工業(yè)生產(chǎn)中還存在乙醇回收等問題,導(dǎo)致生產(chǎn)周期長,成本較高,不利于節(jié)約能源。本文采用殼聚糖澄清技術(shù),工藝簡單,成本低,生產(chǎn)周期短,絮凝速度快,穩(wěn)定性好[6]。殼聚糖絮凝法可代替醇沉法用于澄清五苓滴丸水煎液。

3.4 蒽酮硫酸法的反應(yīng)原理是糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物,可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生有色物質(zhì),反應(yīng)后溶液呈藍綠色,于 625 nm處有最大吸收,顯色與多糖含量成線性關(guān)系。將樣品溶液稀釋到蒽酮-硫酸法測糖的標準曲線范圍內(nèi),可方便、快速、準確地測出樣品中的多糖含量。

[1] 鄭慧敏,鄭梅.五苓散的實驗研究和臨床應(yīng)用的新進展[J].江西中醫(yī)藥,2007,38(4):70-71.

[2] 石鈴,胡利平,浦錦寶,等.殼聚糖的安全性研究[J].中國海洋藥物,2000,19(1):25-28.

[3] 刁波,唐瑛,王曉琨.中藥多糖研究新進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2008,5(3):21-22.

[4] 張彤,徐蓮英,李海燕,等.殼聚糖用于大青葉等中藥浸提液澄清效果的研究[J].中成藥,1998,20(10):7-10.

[5] 彭平建.水醇法應(yīng)用的若干問題[J].基層中藥雜志,1998,12 (4):46-48.

[6] 梁宇紅.黃芪口服液制備工藝的優(yōu)選[J].實用藥物與臨床, 2008,11(6):386-387.