快速自動化合成18F-FMISO及其質量控制

李 琳，黃飛杰，李敏聰，孫 華

昆明醫學院第三附屬醫院，云南省腫瘤醫院PET/CT中心，云南 昆明 650118

1-H-1-(3-18F-2-羥基丙基)-2-18F-硝基咪唑(18F-labelled fluoromisonidazole,18F-FMISO)是一種常用的硝基咪唑類乏氧顯影劑，主要應用于乏氧組織的顯像。它通過主動擴散進入細胞，硝基在硝基還原酶作用下被還原。在正常細胞內，硝基還原產物可立即被氧化；而在缺氧細胞內，硝基還原產物則不能發生再氧化，還原產物與細胞內大分子物質發生不可逆結合，滯留于缺氧細胞中，其濃集程度與乏氧程度成正比。因此，18F-FMISO可以用來表示腫瘤組織中細胞的缺氧程度[1]。目前18F-FMISO已用于測定鼻咽癌、頭頸部惡性腫瘤乏氧狀況及其放化療效果，也有文獻報道[2-3]可用于心臟缺血及灌注的研究。

18F-FMISO的化學合成方法主要有直接與間接標記法兩大類[4-5]。前一類用兩步法合成，即18F-首先與前體發生親核反應，接著進行水解反應去掉保護前體的基團。后一類是在堿性條件下，18F-標記的反應中間體與硝基咪唑發生偶聯反應。前一類方法反應過程簡單、合成效率高，利于自動化合成；后一類方法由于常規化學物質中的溶劑二甲基亞砜(DMSO)不易處理、合成效率低，應用較少。

傳統方法合成18F-藥物多用氟多功能模塊，但氟多功能模塊價格昂貴、合成時間長，放射性損失較多，且操作復雜。Chang等[6]采用機器人系統合成18F-FMISO，降低了合成成本，簡化了操作步驟，但機器人系統合成效率低，僅為30%。文獻[4,7-8]報道有不同公司18F-FDG模塊合成18F-FMISO，其中有GE、IBA和CTI公司等，并取得了較好的合成效率，但它們操作繁瑣，合成成本較高。本工作擬在對傳統FDG模塊進行改良的基礎上，采用兩步法單管合成18F-FMISO,并對其進行較系統的質量控制。

1 材料和方法

1.1 試劑

H218O，豐度97%，美國Isotec公司；1-(2’-硝基-1’-咪唑基)-2-O-四氫吡喃基-3-O-甲苯磺酰基丙二醇(1-(2’-nitro-1’-imidazolyl)-2-O-tetrahydropyranyl-3-O-tosyl-propanediol，NITFP)及3-18F-2-羥基丙烷-2-硝基咪唑標準品，德國ABX公司；無水乙腈(色譜級)、Kryptofix222(K222)，美國Sigma公司；Sep-Pak Light QMA、Al2O3柱、C18柱，美國Waters公司；AG11A8柱、AG50柱，美國Bio-Rad公司；NaOH，分析純，北京化學試劑公司；硅膠板，英國Whatman公司；廣泛pH試紙，上海化學試劑公司；NaHCO3，分析純，上海虹光化工廠。

1.2 動物

昆明種小鼠，體重為20～25 g，均為雄性，購自昆明醫學院實驗動物中心，動物生產許可證為SCKK(滇)2005-0008。室溫：(20±2) ℃，自然光照，自由進食進水。

1.3 儀器

Sumitomo HM-10加速器，日本住友重機械工業株式會社；FDG-CPCU，北京派特生物技術有限公司；活度計和Radio-TLC放射性薄層掃描儀，美國Bioscan公司；分析型HPLC，配有UV201型紫外檢測器、RI200型示差檢測器、606泵、626泵、Sep-Pak C18柱，德國Alltech公司；BIOGRAPH 16 PET/CT掃描儀，德國Siemens公司。

1.4 實驗方法

1.4.1系統組成 采用兩步法單管合成，即親核反應在反應管中進行，接著轉移至水解柱上水解。整個合成過程通過計算機自動化控制FDG-CPCU完成。

1.4.218F-的生產 采用回旋加速器通過18O(p, n)18F核反應，應用小體積18O-H2O靶，用10 MeV、60 μA的質子束流連續轟擊靶30 min。

1.4.318F-FMISO的自動化合成18F-FMISO的合成路線示于圖1。自動化裝置示于圖2。1.5 mL K2CO3/K222乙腈溶液淋洗QMA將18F-淋入反應管，通入氮氣加熱除水，加入2 mL無水乙腈共沸除水。將5 mg的NITFP溶解于1.5 mL無水乙腈，通入氮氣條件下加熱105 ℃，反應300 s，之后除乙腈。加入2 mL 1 mol/L HC1，在110 ℃下加熱水解180 s。加入1 mL 2 mol/L檸檬酸鈉中和。混合物分別通過AG50柱、AG11A8柱、Al2O3柱、C18柱、無菌濾膜，進入收集瓶，收集產品。

圖1 18F-FMISO的合成路線 Fig.1 Scheme of 18F-FMISO synthesis

圖2 合成18F-FMISO的自動化裝置示意圖 Fig.2 Schematic diagram of 18F-FMISO automatic apparatus

1.4.4質量控制及檢測方法 透過鉛玻璃肉眼觀察產品外觀；pH試紙檢測pH值；活度計測定產品活度；Radio-TLC及Radio-HPLC測產品的放化純度。Radio-TLC：支持體為硅膠板，展開劑為95%的乙腈。Radio-HPLC：流動相為90%的乙醇，流速1 mL/min，紫外波長254 nm，碳水化合物分析柱。

1.4.5穩定性實驗

(1) 體外穩定性實驗

在室溫下，不同時間1、2、3、4、5、6 h測定了18F-FMISO注射液的放化純度。測定方法同1.4.4節。

(2) 血清溫育實驗

為了觀察18F-FMISO在動物體內的穩定性，進行了血清溫育實驗。將18F-FMISO分別用生理鹽水及新鮮人血清稀釋10倍，在與體溫同溫度(37 ℃)的水浴中保溫放置48 h，以便更好地模擬動物體內環境。在此期間選擇12、24、36、48 h各取適量樣品進行放化純度測定，方法與上同。

1.4.6急性毒性實驗 將24只正常昆明小鼠分成2組，其中一組按照每克體重5.55 MBq放射性活度尾靜脈注射18F-FMISO，另一組尾靜脈注射生理鹽水，飼養，給藥前后觀察小鼠體重、進食、進水狀況，密切觀察異常毒性癥狀，特別是給藥后的1、2日。以后每日觀察1次，觀察7 d。觀察癥狀包括：① 行動，有無不安定、多動、發聲；② 神經系統反應，有無舉尾、振顫、痙攣，有無運動失調、姿態異常；③ 自主神經系統反應，有無眼球突出、流涎、下瀉、豎毛、皮膚變色；④ 有無死亡。并記錄體重、毒性反應和死亡情況，實驗結束對存活動物進行解剖，如有病變進行組織學觀察。

1.4.7無菌實驗 取稀釋后的18F-FMISO注射液分兩管用營養肉湯培養基進行細菌培養。37 ℃培養18～24 h后，觀察營養肉湯培養基是否完整光滑、有無渾濁及細菌生長情況，以此檢查18F-FMISO是否無菌。

1.4.8正常小鼠體內藥代動力學實驗 將昆明種小鼠20只隨機分成5組，每組4只，尾靜脈注射經生理鹽水稀釋的18F-FMISO，每只小鼠220 GBq/L。分別于注射30、50、80、110 min后放血處死動物，摘取心、肝、肺、腎、脾、腦等臟器，用生理鹽水清洗干凈后分別稱重，測定放射性計數率。另取小鼠5只，注射18F-FMISO后用活度計進行整體計數，并換算為計數率。取10%注射量的注射液(20 μL，活度約4.4 MBq)在活度計上進行測定。經時間衰減校正后，按(1)式計算不同時間小鼠每克組織18F-FMISO放射性攝取率[9]。用3P87程序對放射性濃度-時間曲線進行擬合，自動選擇判定旁室模型并計算藥動學參數。

每克小鼠組織放射性攝取率=

100%(%kg dose/g)

(1)

1.4.9肺癌模型小鼠體內分布實驗及顯像

(1) 肺癌小鼠模型的建立

將正常傳代培養的YTMLC瘤株細胞，制成(2×105/mL)單細胞懸液，取0.1 mL皮下接種于小鼠右上肢腋下。造模6～7 d，使瘤體直徑為0.5～0.8 cm。病理HE染色鏡下癌組織呈腺樣結構，腺腔內有乳頭狀突起。癌細胞呈圓形及梭形，細胞質豐富，核呈圓形，核仁明顯、核分裂多見。

(2)18F-FMISO在肺癌模型小鼠的體內分布及顯像

采用隨機配對原則將模型小鼠按藥代動力學方法進行實驗分組，其余處理方法同1.4.8節所述，并計算每克小鼠組織放射性攝取率。

取給藥后90 min的肺癌模型小鼠，處死后固定于PET/CT掃描床上，采用3D模式采集，重建后得到校正的18F-FMISO分布圖。

1.4.10人體輻射吸收劑量的計算

(1) 人體組織放射性滯留率

將小鼠體內分布實驗數據換算成70 kg標準成人的體內分布數據，按式(2)[6]計算人體組織放射性攝取率Ai(t)/A0。

(2)

式中，Ai(t)/A0，用藥后t時刻人體組織i的放射性滯留率；Ai(t)，用藥后t時刻人體組織i的計數率，min-1；A0，人體注射18F-FMISO的計數率，min-1。人的臟器和全身質量采用MIRD標準成人數據，小鼠質量采用本實驗用鼠測定值的均值，進行整體測量的小鼠以注射后即刻測得的計數率(min-1)為注射劑量，按式(1)和(2)計算各時相的人體臟器和全身放射性滯留率Ai(t)/A0。

(2) 采用MIRD法計算人體內輻射劑量[10]

(3)

(3) 按式HE=ΣWtHt計算有效劑量，式中，HE為有效劑量(Sv)；Wt為t器官的組織權重因子(無量綱)；Ht為t靶器官的當量劑量(Sv)。已知，Ht=WRDt，WR為輻射權重因子(無量綱)。對18F-，WR=1.0，故Ht與Dt同值。本研究在計算有效劑量HE時，假定除本研究估算的靶器官吸收劑量外，其它靶器官吸收劑量取平均全身吸收劑量。

2 結果和討論

2.1 18F-FMISO的自動化合成

本實驗在對現有FDG專用合成模塊(CPCU)計算機程序進行修改的基礎上，采用適宜的密封方法阻斷反應管與大氣的連通，使得改良后的FDG模塊在氟化反應時可以密封，提高了氟化反應溫度，減少了合成過程中的放射性損失，從而有利于18F-FMISO的合成。改進的FDG模塊為合成18F-藥物創造了條件，充分發揮了FDG模塊的潛力。在幾十次的放化合成中均取得了較好效果。利用該全自動合成裝置，不僅保證了較高的放化產率和化學純度，而且避免了操作人員暴露于強輻射環境中。

實驗采用了兩步法，第一步為氟化反應，第二步為水解反應。而18F-FMISO的放射化學產率主要取決于第一步——氟化反應，這與前體NITFP的用量和標記溫度有較大關系。實驗所用的前體NITFP質量為5 mg。實驗所需親核反應溫度為105 ℃[11]，這一溫度高于乙腈的沸點(82 ℃)，因此，本工作采用改良的FDG模塊，密封體系下自動化合成18F-FMISO。105 ℃下反應300 s，合成時間25 min，不校正合成效率為(50.3±1.6)%，校正合成效率為(61.8±2.3)%。

2.2 質量控制

透過鉛玻璃肉眼觀察產品為無色透明液體，pH=6.0～7.0，放射性濃度200～220 GBq/L，18F-FMISO平均活度2.1×103MBq，摩爾活度不小于4.0 TBq/mol。

放射化學純度是衡量產品質量最重要的質量控制指標之一。本工作采用了TLC法及HPLC法對18F-FMISO的放射化學純度進行了測定。TLC測量產品的放化純度，游離18F-的Rf=0.1，18F-FMISO的Rf=0.6；HPLC測量放化純度，游離18F-的tR=4.0 min，18F-FMISO的tR=5.3 min，與紫外所測標準品18F-FMISO的吸收峰一致；2種方法所測放射化學純度均大于98%。

2.3 穩定性實驗

2.3.1體外穩定性實驗 在室溫下，18F-FMISO注射液在1、2、3、4、5、6 h內的放化純度分別為98.59%、98.57%、98.57%、98.56%、98.53%、98.53%，沒有發生明顯變化。

2.3.2血清溫育實驗18F-FMISO注射液37 ℃不同時間的放化純度(RCP)列入表1。由表1可知，18F-FMISO在生理鹽水和血清中保溫48 h，標記的18F-仍與咪唑化合物牢固結合，幾乎沒有放射性損失。放化純度保持在98.6 %以上。

表1 18F-FMISO注射液37 ℃不同時間的放化純度(RCP)Table 1 Radiochemical purity of 18F-FMISO injection in different time at 37 ℃

2.4 急性毒性實驗

尾靜脈注射18F-FMISO后，觀察各項指標：① 小鼠體重正常；② 行動如前，無不安定、多動、發聲；③ 神經系統方面，無舉尾、振顫、痙攣、運動失調、姿態異常等反應；④ 自主神經系統方面，未發現眼球突出、流涎、下瀉、豎毛，皮膚顏色正常、呼吸正常；⑤ 觀察1周后無小鼠死亡。計算小鼠存活率為100%。試驗結束后將存活小鼠進行解剖，未發現重要器官病變。與注射生理鹽水組相比，SPSS組間統計學分析無顯著性差異。

2.5 無菌實驗

取稀釋后的18F-FMISO注射液分2管用營養肉湯培養基進行細菌培養, 37 ℃培養18～24 h后進行觀察，營養肉湯培養基完整光滑，無渾濁，無細菌生長。

2.6 正常小鼠體內藥代動力學實驗

18F-FMISO在正常小鼠體內的生物分布結果列入表2。由表2可知，18F-FMISO在正常小鼠體內的放射性主要分布于腎臟、肝臟等腹腔臟器。由于18F-FMISO的脂溶性較高，腦內放射性較高，且從30 min到110 min清除較慢。肝、腎放射性較高，說明該藥經消化系統代謝。

18F-FMISO的藥代動力學參數列于表3。18F-FMISO的藥代動力學符合三室模型[12]。靜脈注射18F-FMISO后，藥物從中央室進入淺外室，t1/2π僅為0.4 min；第二個時相是藥物向深外室分布的α時相，伴隨中央室血藥濃度降低, 深外室藥量逐漸增高，t1/2α=6.5 min；約經30 min后，血藥濃度逐漸達到動態平衡，進入血液和組織藥量平行下降的β時相，t1/2β=79.6 min。消除相半衰期遠大于分布相半衰期。其主要原因可能是18F-FMISO在平衡前被總血池快速稀釋和被組織迅速攝取、而代謝物卻較長時間滯留于各組織中的緣故。

2.7 肺癌模型小鼠體內分布實驗

注射后不同時相18F-FMISO在肺癌模型小鼠體內的生物分布結果列入表4。由表4可知，肺癌模型小鼠注射18F-FMISO后，全身各臟器除腫瘤外，在注藥30 min均呈現高的放射性攝取，隨著時間的推移放射性迅速降低。腫瘤組織攝取18F-FMISO在注藥后80 min達到最大值，此后逐漸減低。不同時相點腫瘤對其它組織的每克組織放射性攝取率存在顯著性差異(P<0.01)。各臟器不同時相18F-FMISO的放射性攝取之間也存在顯著性差異(P<0.01)。這與正常小鼠體內放射性分布相一致。放射性主要分布在腎、肝等腹腔臟器，最高的為腎臟，而模型小鼠腫瘤組織也有較高的放射性攝取。結果表明，18F-FMISO在低氧組織中有較高的攝取。腫瘤細胞是一種低氧細胞，18F-FMISO能夠濃集于其周圍，定量在分子水平觀察機體內腫瘤的乏氧情況，彌補了傳統的18F-FDG PET檢查的不足。通過18F-FMISO用于腫瘤乏氧顯像和測定，使臨床醫生能夠提高腫瘤診斷準確性，同時也提供了一種新的檢測腫瘤療效、判斷腫瘤復發危險性的研究方法，并可能有助于對腫瘤的預后進行科學的評估。但結果也表明，18F-FMISO在肝、脾、腎內放射性較高，而18F-FMISO用于這些部位腫瘤的乏氧評價，會出現假陽性的結果，因此仍需開發新的乏氧顯像劑對腹腔腫瘤進行乏氧評價。

表2 18F-FMISO在正常小鼠體內的生物分布Table 2 Biodistribution of 18F-FMISO in normal mice

注(Note)：n=6；a:P<0.01,與30 min比較(Compared with data at 30 min);b:P<0.01,與50 min比較(Compared with data at 50 min);c:P<0.01,與80 min比較(Compared with data at 80 min);d:P<0.01,與110 min比較(Compared with data at 110 min)

表3 18F-FMISO在正常小鼠體內的藥代動力學參數Table 3 Pharmacokinetic parameters of 18F-FMISO in normal mice

注(Notes)：n=4；其中π、α、β為混雜參數；t1/2π、t1/2α、t1/2β分別為吸收項、分布項、消除項半衰期；K12、K21、K13、K31、K10分別為18F-FMISO由中央室進入淺外室、淺外室進入中央室、深外室進入中央室、中央室進入深外室以及中央室進入血液和組織的轉運速率常數；Vc為表觀分布容積；CL為總清除率；AUC為血藥濃度-時間曲線下面積(n=4.π,α,βare compound parameters;t1/2π,t1/2α,t1/2βare half-life of absorption, distribution and elimination phases, respectively;K12,K21,K13,K31,K10are transport rate constants of18F-FMISO which from center to superficial-external compartment, from superficial-external to center compartment, from deep-external to center compartment, from center to deep-external compartment, and from center compartment to bloods and tissues, respectively;Vcis apparent volume of distribution;CLis clearance;AUCis area of drug concentration-time curve)

表4 注射后不同時相18F-FMISO在肺癌模型小鼠體內的生物分布Table 4 Biodistributions of different time-phase after injecting 18F-FMISO in bearing lung tumor mice

注(Notes)：n=7；a:P<0.01,與30 min比較(Compared with data at 30 min);b:P<0.01,與50 min比較(Compared with data at 50 min);c:P<0.01,與80 min比較(Compared with data at 80 min);d:P<0.01,與110 min比較(Compared with data at 110 min)

2.8 肺癌模型小鼠PET顯像

荷瘤小鼠的18F-FMISO顯像結果示于圖3。由圖3可知，腫瘤對示蹤劑有明顯的攝取，但同時小鼠腹部有大片放射性濃集，這是由腹部肝、腎及腸道內部較高的放射性濃集成一片所致，表明該示蹤劑不適于腹部腫瘤乏氧的評價。

圖3 18F-FMISO在荷肺癌鼠90 min時的PET顯像Fig.3 Bearing lung tumor (arrows) mice of PET imaging at 90 min with 18F-FMISO

2.9 人體內照射吸收劑量的計算

2.9.118F-FMISO在人體各器官內的放射性滯留率-時間曲線 按式(1)和(2)將小鼠體內18F-FMISO的分布資料換算成70 kg標準人的體內分布數據，計算人各臟器的放射性滯留率(Ai(t)/A0)，繪制各臟器18F-FMISO在不同時相時的放射性滯留率-時間曲線，結果示于圖4。由圖4可知，在0～30 min內，腎的放射性滯留率最高，肝、肺、脾放射性滯留率也較高，心臟和腦的放射性滯留率較低。

圖4 由小鼠實驗結果推算18F-FMISO在人體內不同器官的放射性滯留率-時間曲線Fig.4 Typical fractional activity-time curves in different human organs measured from the distribution of 18F-FMISO in mice■——心(Heart)，●——肝(Liver)，▲——肺(Lung)，▼——脾(Spleen)，◆——腎(Kidney)，?——腦(Brain)，?——腫瘤(Tumor)

3 結 論

采用改良的FDG-CPCU，以NITFP為原料，經氟化、水解兩步法全自動快速合成了18F-FMISO，并進行了較系統的質量控制。結果表明，各項指標均符合要求，但荷瘤小鼠的18F-FMISO顯像結果提示，腫瘤對示蹤劑有明顯攝取的同時小鼠腹部也有大片放射性濃集，因此在行腹部腫瘤顯影時，還應開發或結合其它特異性正電子藥物聯合診斷。

表5 1 MBq 18F-FMISO在人體各臟器的累積活度和體內照射吸收劑量Table 5 Cumulated activities and radiation dosimetry of 1 MBq 18F-FMISO to human subjects

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