125I/111In標記的抗EGFR單克隆抗體Panitumumab的制備及其在正常鼠體內的生物分布

劉 妍，靳存敬，楊素娟，賈 兵，王 凡，劉昭飛，2，*

1.北京大學 醫學同位素研究中心，北京 100191 2.北京大學 基礎醫學院 放射醫學教研室，北京 100191

EGFR(表皮生長因子受體，epidermal growth factor receptor)是具有配體依賴性和酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白家族，它在多種人類腫瘤中均呈現高表達，如結直腸癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等。EGFR對于調節腫瘤細胞的生長、生存、修復、新生血管生成、侵襲和轉移等具有重要的作用[1-2]，因此它成為目前腫瘤分子靶向治療的重要靶點。近些年來，人們一直致力于尋找能抑制EGFR表達或阻斷EGFR信號傳導的抗癌療法，而開發可拮抗EGFR胞外配體結合區的單克隆抗體成為這其中的一個熱點。這種靶向療法降低了傳統的細胞毒療法對正常組織的毒性，并且靶向治療與傳統療法聯合使用可能產生協同作用[3]。另外，目前用不同放射性核素標記的靶向EGFR抗體已經受到廣泛關注，并用于腫瘤的SPECT和PET顯像以及腫瘤治療的研究[4-6]。

Panitumumab(ABX-EGF)是第一個EGFR靶向的完全人源化單克隆抗體(IgG2亞型)，由Abgenix和Amgen公司采用XenoMouseTM技術從一組該類抗體中篩選獲得。Panitumumab與EGFR具有高親和性，與EGFR結合從而阻止其配體EGF和TGF-α(transforming growth factor-α，轉化生長因子α)等與EGFR的結合，進而阻止下游信號的激活。2006年9月，Panitumumab被FDA批準，用于治療常規化療后轉移的結直腸癌患者[7-8]。Niu等[9]首先用64Cu標記Panitumumab用于高表達EGFR的腫瘤模型的PET顯像，而其它核素標記的Panitumumab國內外尚無文獻報道。在本研究中，采用125I和111In分別標記Panitumumab，在體外測定標記物的免疫活性，并對其在正常鼠體內的生物分布進行比較，其目的是評價不同的放射性核素標記對抗體體內外性質的影響。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

111InCl3溶液和Na125I溶液(無載體)，美國Perkin Elmer公司；完全人源化抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體Panitumumab(Vectibix，帕尼單抗)，美國斯坦福大學陳小元教授惠贈；快速薄層層析-硅膠紙(ITLC-SG)，美國Gelman公司；PD-10脫鹽柱(Sephadex G-25)，美國GE公司；Iodogen (1,3,4,6-四氯3,6 -二苯-甘脲)，美國Sigma公司；雙功能偶聯劑DOTA，購自美國Macrocyclics公司；1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)-propyl]carbodiimide(EDC)及N-hydro-xysulfonosuccinimide(SNHS)，購自美國Sigma公司；DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養基和胰蛋白酶，美國GIBCO/BRL公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；Tween-20，美國Sigma公司；其它常規化學試劑均為分析純，北京試劑公司產品。

所用緩沖液、槍頭、反應管等均經去離子處理，所有實驗用水為去離子水(18.2 MΩ)。

1.2 儀器

CRC-15R放射性活度計，美國Capintec公司；1470-002全自動γ計數儀，美國Perkin Elmer公司；AR-2000放射性薄層掃描儀，美國Bioscan公司。

1.3 實驗動物

BALB/c小白鼠，4～5周齡，雌性，約20 g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 DOTA偶聯Panitumumab

采用我們前期報道的方法將雙功能偶聯劑DOTA活化[10]。簡言之，DOTA(100 μL，溶于0.1 mol/L NaOH)與EDC(100 μL，溶于H2O)和SNHS(100 μL，溶于H2O)按照n(DOTA)∶n(EDC)∶n(SNHS)=10∶5∶4的摩爾比混合，置4 ℃反應30 min。將活化好的DOTA(DOTA-OSSu)與抗EGFR單克隆抗體Panitumumab以1∶200的摩爾比混合，在0.1 mol/L NaHCO3溶液(pH=9.0)中4 ℃振蕩反應過夜后，反應混合液用PD-10脫鹽柱純化。根據DOTA-Panitumumab及已知濃度的Panitumumab在280 nm波長處的吸光度值計算DOTA-Panitumumab的濃度。

2.2 Panitumumab及DOTA-Panitumumab的125I標記

將15 μL Panitumumab(300 μg)和30 μL DOTA-Panitumumab(300 μg)分別加至2個涂有50 μg Iodogen的小瓶中，再分別加入135 μL和120 μL的磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH=7.4)，然后分別向瓶中加入12 μL Na125I溶液(約25.6 MBq)，混合均勻室溫反應5 min后，吸出反應液以終止反應。反應混合物分別經PD-10脫鹽柱純化(以PBS為流動相)后備用。

2.3 111In-DOTA-Panitumumab的制備

1.5 mL EP(Eppendorf)管中分別加入50 μL的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH=5.5)、200 μg DOTA-Panitumumab(20 μL)以及20 μL111InCl3(約111 MBq)。37 ℃振蕩反應1 h后，用PD-10柱純化產物111In-DOTA-Panitumumab，以PBS為流動相。

2.4 質控方法

質控采用快速薄層層析法(ITLC)。取1 μL標記產物點樣于ITLC-SG板(10 mm×100 mm)，125I標記物在85%甲醇的展開體系中上行展開，111In標記物在10 mmol/L EDTA的展開體系中展開，自然晾干后用放射性薄層掃描儀測量并計算標記率或放射化學純度。

2.5 111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的體外穩定性

取100 μL純化后的111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab分別置于生理鹽水(NS)和胎牛血清(FBS)溶液中，37 ℃振蕩孵育。用ITLC監測不同時間點的放射化學純度，以評價標記物的體外穩定性。

2.6 細胞培養

UM-SCC-22B人頭頸癌細胞購自美國ATCC,培養于φ=10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中。細胞置于飽和濕度、37 ℃含5% CO2的恒溫培養箱中培養。UM-SCC-22B細胞高表達表皮生長因子受體(EGFR)[11]。

2.7 111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的放射免疫活性測定

取6個EP管分為總結合組和非特異性結合組，每組3個平行樣。每管均加入500 μL細胞懸液(約106個細胞)和100 μL111In-DOTA-Panitumumab(約167 Bq)稀釋液。然后在總結合組中每管加入100 μL 1% BSA(溶于PBS)；非特異性結合組中每管加入100 μL過量未標記Panitumumab(約100 μg，溶于1% BSA)溶液。反應管混合均勻后，置于4 ℃層析柜中輕輕振蕩反應過夜。結束后取出試管，離心，并用PBS反復洗滌4～6次。離心后經γ計數器測定每管細胞結合的放射性計數率(min-1)，計算放射免疫活性(細胞結合量/加入總量)。

125I-Panitumumab的放射免疫活性測定步驟同上。

2.8 正常鼠體內生物分布

將60只BALB/c小白鼠隨機分成3組，每組20只。每組分別經尾靜脈注射185 kBq(100 μL溶于生理鹽水)125I-Panitumumab、DOTA-Panitumumab-125I及111In-DOTA-Panitumumab，并于注射后4 h、1 d、3 d、5 d和7 d按組(每組4只)將實驗小鼠處死，取血及主要臟器，稱重并用γ計數儀測量放射性計數，經衰變校正后計算每克組織的百分注射劑量率(Up，%ID/g)。

2.9 數據分析

使用Prism 4.0軟件對實驗數據進行分析，P≤0.05為有顯著性差異。

3 結果和討論

3.1 標記物的制備與質控

標記物的標記率和放化純結果列于表1。Panitumumab及DOTA-Panitumumab均具有較高的111In和125I標記率，然而111In標記物的標記率(88%)明顯低于125I標記物的標記率(94%)，這可能是由于111In需要通過雙功能螯合劑與抗體偶聯，所以它比125I更難標記到抗體上。經PD-10脫鹽柱純化后，111In和125I標記的Panitumumab均具有高的放射化學純度(>98%)。

3.2 111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的體外穩定性結果

通過對111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab在生理鹽水(NS)和胎牛血清(FBS)中的放射化學純度監測(圖1)顯示，2種標記物在體外均有很好的穩定性，72 h時，在2種介質中的放化純均大于90%。

圖1 125I-Panitumumab(a)和111In-DOTA-Panitumumab(b)在生理鹽水(NS)和胎牛血清(FBS)中的穩定性Fig.1 In vitro stability of 125I-Panitumumab(a) and 111In-DOTA-Panitumumab(b)in saline (NS) and fatal bovine serum (FBS)×——NS，□——FBS

3.3 111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的放射免疫活性分數測定結果

111In-DOTA-Panitumumab和125I-Panitumumab的放射免疫活性分數分別為(58.32±4.84)%和(81.66±3.15)%(圖2)，說明2種標記物均保持了良好的免疫活性。111In-DOTA-Panitumumab的放射免疫活性低于125I-Panitumumab，這可能是由于雙功能螯合劑與抗體偶聯過程對抗體活性有一定的影響。

3.4 125I-Panitumumab、DOTA-Panitumumab-125I和111In-DOTA-Panitumumab在正常鼠內的生物分布

表2—4分別列出了125I-Panitumumab、DOTA-Panitumumab-125I和111In-DOTA-Panitumumab在BALB/c小白鼠體內的分布數據，圖3比較了這3種標記物在主要臟器及血液中的清除情況。

根據生物分布數據，在注射后4 h，3種標記物111In-DOTA-Panitumumab、125I-Panitumumab和DOTA-Panitumumab-125I在血液中的放射性攝取分別為(46.65±3.96)、(39.08±1.16)、(36.77±3.03)%ID/g，隨著時間的延長，3種標記物在血液中迅速清除，到注射后168 h，它們在血液中的放射性攝取分別降至(3.63±2.64)、(14.16±1.00)、(1.69±0.13)%ID/g。3種標記物在腎臟中的放射性攝取較低，在肝臟和脾臟中的放射性攝取較高，說明標記物主要是通過肝臟代謝的。3種標記物在肝臟和脾臟中的放射性攝取差異最大(圖2)。111In-DOTA-Panitumumab在實驗過程中所有時間點的肝臟攝取都顯著高于DOTA-Panitumumab-125I和125I-Panitumumab(P<0.000 1)。這可能是由于3種標記物的代謝產物在體內分布性質的不同造成的。標記物經肝臟代謝時，會進入肝細胞內的溶酶體，經過蛋白酶裂解后產生代謝產物[12]，這些代謝產物要通過簡單擴散或者氨基酸轉運子離開溶酶體腔。根據Duncan等[13]推測，111In-DOTA-Panitumumab的代謝終產物大部分為111In-DOTA-lysine(賴氨酸)，由于溶酶體中不存在轉運它的轉運子，所以它難以離開肝細胞，從而造成了放射性在肝細胞中的滯留。而125I標記物的代謝產物在細胞質中易發生脫碘作用，游離碘很容易從細胞內溢出[14]。在注射后4 h，125I-Panitumumab在肝臟中的攝取為(6.24±0.77)%ID/g，也顯著低于DOTA-Panitumumab-125I((10.99±1.34)%ID/g，t=6.136，P=0.000 9)，說明了DOTA的連接本身也會增加肝臟的攝取。這可能是由于DOTA-Panitumumab的代謝產物具有陰離子性質，在pH=5.0的溶酶體中難以進行簡單擴散，所以連有DOTA的標記物在肝臟中更容易累積。另外，從生物分布數據中還可以看出，3種標記物在肺中的攝取也較高，這可能是由于EGFR在正常的肺組織中也有少量的表達[15]。

圖2 125I-Panitumumab(a)和111In-DOTA-Panitumumab(b)的放射免疫活性分數Fig.2 Radioimmunoreactive fractions of 125I-Panitumumab (a) and 111In-DOTA-Panitumumab (b)

組織(Tissues)Up/(%ID·g-1)4h1d3d5d7d血(Blood)39 08±1 1628 26±1 7022 14±2 2415 41±1 5314 16±1 00肝(Liver)6 25±0 774 04±0 533 12±0 671 94±0 262 29±0 58脾(Spleen)4 64±0 383 15±0 382 40±0 411 92±0 211 69±0 28腎(Kidney)8 46±0 305 69±0 173 31±0 742 96±0 313 04±0 15胃(Stomach)3 84±0 483 34±0 393 03±0 692 32±0 171 88±0 09腸(Intestines)7 11±1 075 40±0 575 47±0 743 77±0 613 22±0 33心(Heart)7 50±0 125 04±0 593 90±0 802 62±0 302 36±0 27肺(Lung)13 14±2 828 78±1 567 01±1 005 23±0 585 13±0 55肌肉(Muscle)1 70±0 282 52±0 362 09±0 401 40±0 151 17±0 14骨(Bone)3 43±0 892 28±0 591 65±0 271 16±0 200 92±0 11

注(Note)：n=4

表3 DOTA-Panitumumab-125I的正常鼠生物分布Table 3 Biodistribution of DOTA-Panitumumab-125I in normal mice

注(Note)：n=4

表4 111In-DOTA-Panitumumab的正常鼠生物分布Table 4 Biodistribution of 111In-DOTA-Panitumumab in normal mice

注(Note)：n=4

圖3 3種標記物在血液(a)、肝臟(b)、腎臟(c)和脾臟(d)中的清除情況比較Fig.3 Comparison of blood (a), liver (b), kidney (c), and spleen (d) clearance of three tracers□——125I-Panitumumab，▲——DOTA-Panitumumab-125I，×——111In-DOTA-Panitumumab

以上實驗結果顯示，125I標記簡單，對標記物活性影響小，但125I標記物在體內容易脫碘，所以不能準確地反映出標記物在體內分布的情況。雖然111In標記對抗體活性影響比125I大，但仍然保持較好的免疫活性，并且111In標記物在體內性質穩定，更能體現出抗體在體內的分布情況。然而，111In標記物的最大缺點是在肝臟中攝取較高，滯留時間較長。因此在應用111In作為顯像核素時，如何降低標記物在肝臟中的攝取還有待研究。

4 結 論

本研究中，Panitumumab的125I和111In標記均具有較高的標記率，經PD-10純化后放化純均高于98%。125I和111In標記的Panitumumab均具有較高的體外免疫活性，且125I-Panitumumab具有比111In-DOTA-Panitumumab更高的放射免疫活性分數。生物分布實驗數據顯示，在實驗中所有的時間點，111In-DOTA-Panitumumab在肝臟和脾臟中的攝取均顯著高于125I標記物，說明不同核素標記對生物分子的體內外性質具有一定的影響。雖然相對于易在體內脫碘的125I標記抗體，111In標記物在體內較為穩定，但是如何降低111In標記物在肝臟中的攝取還有待研究。

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