虎杖提取物對人肺癌A549細胞株抑制增殖和誘導凋亡作用的研究

于柏艷， 孫 抒， 楊萬山， 李香丹

(延邊大學基礎醫學院病理學教研室，吉林延吉133000)

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc)是多年生灌木狀草本，虎杖作為活血化瘀藥，在臨床上已被廣泛應用;研究表明，虎杖在抗腫瘤方面可能扮演著重要角色。本實驗以人肺癌A549細胞株為研究對象，進一步闡明虎杖的抗腫瘤作用及其作用機制，為天然藥物虎杖的開發提供理論和實驗依據。

1 材料

1.1 藥物及試劑 新生小牛血清:華美生物工程公司產品;胰蛋白酶(Tripsin):華美生物工程公司產品;噻唑藍﹙MTT﹚:美國 Sigma公司產品;Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9、bcl-2、Ki-67、p21ras單克隆抗體及S-P通用試劑盒:美國Neo Markers公司產品，購于福州邁新生物技術開發有限公司;原位細胞凋亡檢測試劑盒:德國羅氏公司產品［含末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)，含有核苷酸混合液的反應液及堿性磷酸酶轉化劑(Converter-AP);RNA酶A(RnaseA):美國Sigma公司產品;虎杖提取物:延邊大學藥學院生藥教研室分離提供。

1.2 主要儀器 CO2細胞培養箱:USA產品;酶聯免疫檢測儀:美國RT-2100C型;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS產品;FACS-Calibur型流式細胞儀:美國 Becton Dikinson公司產品。

1.3 實驗細胞 人肺癌A549細胞株購于南京凱基生物公司，由本科室體外傳代培養。

2 方法

2.1 虎杖提取物實驗分組及配制 (1)虎杖樣品購自于延吉市健康路大藥房，由延邊大學藥學院生藥教研室劉永鎮教授鑒定為蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)。稱取虎杖(根及根莖)5 kg粉末備用，用95%乙醇回流提取3次，減壓濃縮提取液，將濃縮后的浸膏用水分散后乙醚萃取，乙醚萃取液用5%NaHCO3溶液進行萃取，所得水層酸化至pH=2，放置，抽濾，水洗沉淀至中性，干燥。得到NaHCO3沉淀物18.58 g，用于本次試驗。初步化學成分分析實驗顯示，虎杖沉淀物中含有蒽醌類化合物，甾體和黃葵內酯等成分，其中蒽醌類化合物約占80%以上，虎杖中主要蒽醌類化合物是大黃素甲醚和大黃素。

(2)藥物分組:虎杖NaHCO3提取物采用20、40、80、160 μg/mL 4種濃度。

(3)藥物所需濃度配制:提取物用0.5%羧甲基纖維素納，生理鹽水和少量的Tween+80在藥液中的最高體積分數低于1×10-4。

2.2 TUNEL染色法檢測細胞凋亡 按說明書進行操作。實驗結果判斷:TUNEL染色中細胞凋亡陽性物質呈棕褐色位于細胞核內，部分細胞漿也可因核DNA碎片的逸出呈陽性著色。每張爬片在400×高倍鏡下觀察5個視野，每個視野下分別計數凋亡細胞和總細胞數并計算凋亡指數(Apoptosis Index，AI)，求其平均值。AI(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。每個指標做3次，每次TUNEL染色中以已知陽性物質的肺癌組織切片為陽性對照，以不含TdT的TdT buffer代替TUNEL反應混合液作陰性對照。

2.3 流式細胞儀檢測 流式細胞術樣品制備:取對數生長期A549細胞，0.25%的胰蛋白酶消化，置于培養瓶中培養，待貼壁后再加入虎杖提取物，使其終濃度為40 μg/mL，對照組加入等體積的生理鹽水。將培養瓶置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，于24 h，48 h后收集細胞，按以下步驟進行:① 冷PBS(pH:7.2～7.4)洗滌2次，1 000 r/min離心，5 min;②在細胞沉淀中加入1 mL冷PBS(pH:7.2～7.4)制備成細胞懸液;③加入3 mL預冷的70%乙醇固定，4℃保存過夜;④將單細胞懸液離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清;⑤冷PBS(pH:7.2～7.4)1 mL洗滌2次，1 000 r/min離心，5 min;⑥ 調整細胞數使其在1×106個/mL;⑦ 加入200 μL NaseA 37℃水浴30 min;⑧ 再加碘化丙錠(PI)染色液800 μL混勻，4℃避光30 min;⑨ 上機進行流式細胞儀測定，記錄激發波長488 nm處紅色熒光，檢測凋亡率，分析細胞周期分布情況。

2.4 免疫細胞化學染色 (1)細胞爬片標本制作如上述，4℃冰乙醇固定30 min，操作方法按S-P試劑盒說明書進行。(2)染色結果判斷:觀察以細胞內見清晰棕色顆粒為陽性細胞。Bcl-2和p21ras以細胞漿為陽性定位;Ki67在胞核中呈棕黃色陽性表達;Caspases-9在胞漿胞核中呈陽性表達;Caspases-3、Caspases-8主要在胞質中或胞質與胞核共表達。以細胞未著色或輕微著色為陰性。每一指標觀察3張細胞爬片，每張片在400×高倍鏡下觀察5個視野，每個視野下分別計數陽性細胞數和總細胞數并計算陽性表達率。陽性表達率(%)=陽性細胞總數/總細胞數×100%。免疫細胞化學染色中以已知陽性物質的組織切片為陽性對照，各組均以PBS代替一抗作為陰性對照。

2.5 統計學處理應用SPSS10.0軟件:數據用ˉx±s表示;MTT法檢測的抑制率之間的比較采用t檢驗;用相關分析與直線回歸計算半數增殖抑制濃度(IC50);Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9、bcl-2、Ki-67、p21ras陽性表達統計分析采用t檢驗進行統計學處理。

3 結果

3.1 TUNEL法檢測虎杖提取物對A549細胞株的誘導凋亡作用 結果顯示:對照組可見少量的凋亡細胞，實驗組凋亡細胞增多。各實驗組，隨著虎杖NaHCO3提取物濃度的增加，凋亡率升高;隨著作用時間的延長，凋亡率升高，見表1。

3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期改變 流式細胞術檢測結果顯示虎杖NaHCO3提取物濃度為40 μg/mL作用于A549細胞株24 h，48 h均出現G0/G1期阻滯，阻滯細胞由G1期向S期的轉化，隨處理時間延長G0/G1期細胞含量上升，S期細胞下降;不同時間段各加藥處理組G0/G1期細胞含量與對照組相比較，均有統計學差異(P＜0.01)，呈時間依賴性(P＜0.01)。見表2。

表1 虎杖NaHCO3提取物對人肺癌A549細胞凋亡率的影響(±s，n=5)

表1 虎杖NaHCO3提取物對人肺癌A549細胞凋亡率的影響(±s，n=5)

注:與對照組比較，**P＜0.01;與前一組比較，△P＜0.01。

劑量/(μg/mL) 凋亡率/%24 h 48 h 2.10±0.37 3.67±0.71 20 15.20±3.40** 22.45±3.03**40 22.67±2.67**△ 36.17±3.04 0**△

表2 相同時間不同濃度虎杖提取物作用于A549細胞周期時相分布(ˉ±s，n=8)

表2 相同時間不同濃度虎杖提取物作用于A549細胞周期時相分布(ˉ±s，n=8)

注:與對照組比較，*P＜0.01。

組別 G0/G1/% S/% G2/M/%A 51.50±3.95 44.83±3.40 3.39±1.17 2.83±1.09虎杖提取物24 h 57.82±3.37* 36.71±4.14* 5.47±1.77* 7.27±2.19*虎杖提取物48 h 65.18±4.74* 24.97±5.77* 9.85±1.87* 9.06±5.42對照組*

3.3 凋亡關鍵效應酶與凋亡相關基因蛋白表達水平的檢測

免疫細胞化學結果表明:虎杖提取物作用于A549細胞24 h后，40 μg/mL濃度組凋亡相關蛋白 Caspase-3、Caspase-8與Caspase-9均有表達，并且表達具有一致性，各組鏡檢相同;從視野內的細胞著色的深淺可以看出表達程度的增多和表達量的增加;統計學分析采用t檢驗可知:實驗組與對照組比較均P＜0.01;同時提取物濃度與Caspase表達的關系具有統計學意義(P＜0.01)，見表3。

表3 用藥前后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的陽性表達率

光鏡下觀察可見:Ki-67蛋白染色位于細胞核，bcl-2和p21ras蛋白位于細胞漿內，對照組陽性細胞數目多且呈棕黃色，40 μg/mL濃度組實驗組陽性細胞減少，染色明顯變淺。實驗組與對照組蛋白表達相比有顯著性差異(P＜0.01)，見表4。

表4 用藥前后Bcl-2、Ki-67、P21ras蛋白的陽性表達率

4 討論

Ki-67抗原是目前較為肯定的細胞核增殖標志基因，且Ki-67有可能作為確定癌前人群中高危個體的生物學標志物［1］。本實驗Ki-67抗原檢測結果發現，虎杖提取物作用于A549細胞后，Ki-67陽性表達率隨濃度與時間的增加而減少，實驗組均顯著低于對照組(P＜0.01)，Ki-67表達明顯減弱，表明大量的癌細胞處于細胞增生周期的靜止期。提示虎杖提取物的活性成分作用于肺癌細胞通過基因調控來抑制腫瘤細胞增殖，從而能阻止癌細胞進入分裂期，從而抑制腫瘤細胞生長。p21ras癌基因參與細胞內信息的傳遞，對細胞周期起調節作用，是腫瘤發生的“啟動因子”［2］。本實驗p21ras抗原檢測結果發現，虎杖提取物作用于A549細胞后，p21ras陽性表達率隨濃度與時間的增加而減少，實驗組均顯著低于對照組(P＜0.01)，p21ras表達明顯減弱，表明大量的癌細胞處于細胞增生周期的靜止期。提示虎杖提取物的活性成分作用于肺癌細胞通過基因調控來抑制腫瘤細胞增殖，從而能阻止癌細胞進入分裂期，從而抑制腫瘤細胞生長。

本實驗流式細胞儀檢測A549細胞加藥處理前后的細胞周期時相分布結果顯示:虎杖提取物40 μg/mL處理24 h，48 h后，實驗組與對照組相比，處于G0/G1期細胞百分含量明顯增加(P＜0.05)。表現出細胞被阻滯于G0/G1期。實驗表明:虎杖提取物具有明顯的G0/G1期阻滯作用，使進入S期的細胞減少，阻礙細胞進行DNA合成，從而抑制細胞生長參與完成其細胞增殖抑制作用。本實驗應用TUNEL法觀察虎杖提取物誘導人肺癌A549細胞株凋亡的情況，實驗結果表明:虎杖提取物可誘導A549細胞凋亡;隨著作用時間延長和作用濃度的提高，凋亡率升高(P＜0.01);表現為時間依賴性和劑量依賴性。由此可推測在虎杖提取物作用的48 h之內其抑制增殖作用主要由誘導凋亡作用而實現，因而完成對腫瘤細胞的殺傷。流式細胞儀檢測細胞凋亡，本實驗中對照組細胞未出現凋亡峰，凋亡率在一定時間范圍內隨著藥物作用時間的增加而上升，實驗組與對照組的相比凋亡率明顯增加(P＜0.05)。FCM的實驗結果結合形態學的凋亡改變進一步表明:虎杖提取物在體外有誘導A549人肺癌細胞株凋亡的作用。

凋亡機制的核心成分是一類蛋白水解酶，統稱為Caspase家族。Caspase家族是一種半胱胺酸蛋白酶家族，該家族的蛋白酶解級聯反應控制著細胞凋亡的發生發展，被認為是細胞凋亡的中心環節和執行者［3-5］。在本實驗中，實驗組Bcl-2的表達明顯下調(P＜0.01)，Caspase-9的表達明顯上調(P＜0.01)，根據上述線粒體通路凋亡機制，可以證明虎杖提取物對細胞凋亡的線粒體通路的影響。在本實驗中Caspase-3的表達上調，而Caspase-3可以直接引起細胞的凋亡。實驗組Caspase-3和Caspase-8的表達明顯高于對照組(P＜0.01)。表明經虎杖提取物作用后的A549人肺癌細胞株可以使Caspase表達上調，從而促進細胞凋亡。證實了虎杖提取物對細胞凋亡的死亡受體通路的影響，虎杖提取物誘導凋亡是通過抑制信號傳導通路上相關酶來實現的，相關基因bcl-2、Caspase-3、Caspase-8和 Caspase-9蛋白均參與了腫瘤形成和發展的共同通路，并且在腫瘤的發生、發展和演變過程中可能起著重要的作用。本實驗證明了在虎杖提取物誘導A549細胞凋亡中，Caspase在細胞凋亡的內外信號傳導途徑中均參與了虎杖提取物誘導細胞凋亡，虎杖提取物能影響A549人肺癌細胞株的凋亡通路。

［1］Ramires M，David L，Leitao D，et al.Ki67 labelling indexin gastric carcinoma sl［J］.J Pathology，1997，182(1):62-67.

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［3］陳海英，陳志武，郭沈波，等.輻射誘導的凋亡及其信號轉導通路研究進展［J］.齊魯醫學雜志，2006，21(4):365-368.

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