HPLC-ELSD法測定不同廠家銀杏葉提取物分散片劑中萜類內酯溶出度

周自桂， 蘇 晉， 金 春， 徐 成， 秦 勇

(江蘇弘惠醫藥有限公司研發部，江蘇南京210008)

銀杏葉分散片［1］是由銀杏葉提取物制成的片劑，其活性成分為總黃酮醇苷和二萜內酯;銀杏酮酯［2-4］為第五代銀杏葉提取物，其活性成分也是總黃酮醇苷和萜類內酯，銀杏酮酯分散片是以銀杏酮酯為原料制成的片劑。這兩類片劑均具有活血化瘀，通絡舒脈的功效，臨床用于治療血瘀型胸痹及血瘀型輕度腦動脈硬化引起的眩暈、冠心病、心絞痛。但在臨床療效上，患者均反映銀杏酮酯分散片療效明顯好于銀杏葉分散片，且療效穩定，而銀杏葉分散片不同廠家之間療效差異也很大。由于藥物的溶出度直接影響藥物在體內的吸收和利用，而國內現行的質量標準均以分散時限作為分散片的控制指標，但這并不能反映產品的內在質量，片劑雖然分散了，但其有效成分并不能馬上溶出，對于那些水溶性差的成分更是難以溶出。有文獻報道［5］通過測定片劑中的總黃酮醇苷的溶出度來評價與控制藥品質量，這確實在質量控制上有了很大的提高。由于銀杏葉提取物的另一類有效成分萜類內酯水溶性更低于黃酮醇苷，故本試驗采用HPLCELSD法［6］測定不同廠家分散片中萜類內酯的溶出度，以期為評價與控制藥品質量提供更充分的依據，保證藥品療效。

1 儀器、藥品、試劑

儀器:ZRS-8智能溶出儀(天津天大天發科技有限公司)、Waters 515泵高效液相，Varian380-LC蒸發光散射檢測器;對照品:白果內酯(批號110865-200404)、銀杏內酯A(批號110862-200608)、銀杏內酯B(批號110863-200508)、銀杏內酯C(批號110864-200505)，均購自中國藥品生物制品檢定所;試劑:乙腈(色譜純)、水(超純水)、其它試劑均為分析純。供試藥品:銀杏酮酯分散片為江蘇A廠產品，其余廠家的產品均為銀杏葉分散片，具體規格見表1。

表1 各廠家分散片規格

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Alltech C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)，流動相:水-乙腈-四氫呋喃(80 ∶8 ∶12);流速:1.0 mL/min;漂移管溫度:105℃，氮氣流速:2.70 mL/min。理論板數按銀杏內酯A峰、銀杏內酯B峰、銀杏內酯C峰和白果內酯峰計算均不低于3 000。

2.2 對照品制備方法

取銀杏內酯A、B、C和白果內酯對照品適量，加甲醇制成每1 mL含銀杏內酯A 30 μg、銀杏內酯B 15 μg、銀杏內酯C 15 μg、白果內酯 50 μg 的混合溶液，即得。

2.3 供試品及自身對照溶液處理方法

2.3.1 供試品溶液

取溶出液7 mL，濾過，精密吸取5 mL，用醋酸甲酯振搖提取2次，每次10 mL，合并醋酸甲酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解置2 mL量瓶中，以流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.2 自身對照溶液

取10片，研細，精密稱取相當于1片的重量，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，超聲提取30 min，取溶液7 mL，濾過，照2.3.1項下供試品處理方法同法制備，即得。

2.4 陰性干擾試驗

按處方比例稱取空白輔料，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，超聲提取30 min，取溶液7 mL，濾過，照2.3.1項下供試品處理方法同法制成陰性樣品溶液。取對照品溶液20 μL、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(見圖1)，結果表明陰性樣品對萜類內酯的測定無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 標準曲線制備

精密吸取對照品溶液 2、5、10、15、20 μL 注入液相色譜儀，以對照品進樣量的自然對數為橫坐標，以峰面積的自然對數為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明白果內酯在102.8～1028 ng、銀杏內酯A在65.4～654 ng、銀杏內酯B在32.8～328 ng、銀杏內酯C在34.4～344 ng范圍內線性關系良好，回歸方程分別為:白果內酯:Y=1.062 3X+6.534 5，r=0.999 9、銀杏內酯 A:Y=1.017 5X+6.456 1，r=0.999 8、銀杏內酯B:Y=1.056 2X+6.054 8，r=0.999 6、銀杏內酯C:Y=1.033 1X+6.882 3，r=0.999 8。

2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，連續進樣5次，銀杏內酯A、B、C和白果內酯峰面積的 RSD分別為0.9%、1.3%、1.1%、0.7%，表明本法精密度良好。

2.7 溶液穩定性試驗

取上述供試品溶液(A 廠)室溫放置，分別于 0、2、4、6、8 h精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，峰面積的RSD為1.2%，表明本供試品溶液室溫8 h內基本穩定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品(A廠，批號090407，含銀杏萜類內酯為5.761 mg/片，其中白果內酯2.578 mg/片、銀杏內酯A 1.546 mg/片、銀杏內酯B 0.987 mg/片、銀杏內酯C 0.65 mg/片)約75 mg，共5份，分別精密加入混合對照品溶液(每1 mL 含白果內酯 514 μg、銀杏內酯 A 327μg、銀杏內酯 B 164μg、銀杏內酯 C 172 μg)2 mL，置100 mL 量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，超聲提取30 min，照2.3項供試品處理方法同法制備，進樣10 μL，用上述色譜條件測定，計算回收率，結果白果內酯、銀杏內酯A、B、C的平均回收率分別為100.2%、98.3%、99.3%、98.5%，RSD分別為2.0%、2.1% 、2.6% 、2.4% 。

2.9 溶出度的測定

取6片，照溶出度測定法(中國藥典2005年版二部附錄ⅩC第三法)，以0.1 mol/L的鹽酸溶液100 mL為溶劑，(37 ±0.5)℃，轉速為 100 r/min，分別于 3、10、20、30、45、60 min取溶液7 mL(同時補充等溫介質7 mL)濾過，照2.3.1項同法制成供試品溶液并按上述色譜條件測定(注:溶出度低于50%時進20 μL，其它進10 μL)，將峰面積取自然對數后代入標準曲線求出供試品濃度的自然對數，再轉換成供試品的量。同時取同一廠家的樣品10片，照2.3.2項制成自身對照溶液，同法測定，并以此做為百分之百的溶出量。再將供試品各時間點的溶出量與相應的百分之百溶出量比較，得出累積溶出百分率，繪制累積溶出曲線(圖2)，結果見表2。

表2 各廠家樣品的累積溶出量(mg)與溶出率(%)

圖2 各廠家樣品的累積溶出曲線

2.10 溶出參數的計算［7］

將各廠家在各時間的累積溶出度輸入計算機，按Weibull分布模型圖 Excel 2003 計算溶出參數［6］T50、Td、m并做方差分析，結果見表3、表4。

表3 各廠家溶出度參數

表4 廠家間的F檢驗

結果表明:A廠與B、D、F廠有顯著性差異，B廠與D、F廠，C廠與D、F廠，D廠與E、F廠，E廠與F廠之間的溶出度均有顯著性差異;而A廠與C、E廠，B、C、E 3廠之間的溶出度無顯著性差異。

3 討論

3.1 溶出方法的選擇 由于分散片質量標準規定必須在3 min內崩解，不必擔心片會漂浮而影響溶出，故直接選擇漿法，比較了轉速為50、75、100 r/min的溶出度，結果50、75 r/min均低于100 r/min，加快攪拌速度則加快擴散，有助于溶出，但過快的攪拌速度與人體內的蠕動不相符，故選擇100 r/min。

3.2 溶出介質及體積的選擇 分別以蒸餾水、0.1 mol/L鹽酸、1.5% 十二烷基硫酸鈉為溶出介質，測定同一廠家(A廠)的藥品在45 min內的溶出度，結果溶出度蒸餾水(77.8%)低于0.1 mol/L鹽酸(96.7%)與1.5%十二烷基硫酸鈉(97.4%)，而0.1 mol/L鹽酸與1.5% 十二烷基硫酸鈉無明顯區別，故選擇0.1 mol/L鹽酸為溶出介質。由于本品內酯規格較小(4.8 mg/片與2.4mg/片)，故選擇介質體積為100 mL。

3.3 結果表明，各廠家樣品的溶出行為有顯著性差異，總體看來A廠的溶出要優于其它廠家，且內酯的含量也明顯高于其它廠家，說明銀杏酮酯做為第五代銀杏葉提取物，其純度確實高于普通的銀杏葉提物，這也可能是患者反映的銀杏酮酯類制劑療效優于銀杏葉提取物類制劑的因素之一吧。對相同規格的不同廠家，其T50大規格(4.8mg/片)樣品D廠家約為其它廠的2倍，小規格(2.4 mg/片)樣品的F也是E廠的2倍多，這表明各廠的產品質量有差異，這可能也是引起臨床療效不穩定的因素之一。

溶出度是評價制劑處方、生產工藝、制劑生物利用度的重要指標，而中藥制劑由于成分及樣品處理復雜，使得其建立有效可控的溶出度方法較為困難，中藥分散片常以分散時限來控制產品質量，實際結果表明，雖然每個廠家的樣品均在3 min內崩解了，但其溶出度卻存在顯著的差異，因為樣品崩解、分散后還需經歷成分的溶出，而對一些疏水性成分則更難溶出，因此測定疏水性成分萜類內酯的溶出能更好的反映藥品的內在質量，且通過溶出度的檢查，能更好的反映藥品制備工藝的優劣，保證臨床療效的穩定有效。

［1］中國藥典［S］.一部.2005.

［2］國家食品藥品監督管理局國家藥品標準，WS-228(z-028)-2000，銀杏酮酯［S］.

［3］楊 光，劉曉軍.重新評價銀杏葉制劑的質量與功效［J］.北京中醫，1999，(3):60-62.

［4］謝德隆，高 崎，黃新生.中國銀杏藥品質量標準體系的建立［J］，世界科學技術-中藥現代化，2002，4(10):61-62.

［5］國家食品藥品監督管理局國家藥品標準，YBZ077432005，銀杏酮酯分散片［S］.

［6］陶 紅，張 韜，單 義.RP-HPLC測定不同廠家銀杏葉片劑中總黃酮醇苷溶出度［J］.中成藥，2009，31(8):1226-1229.

［7］胡祥珍，董 藎.Excel在測定藥物制劑溶出度參數數據處理中的應用［J］.解放軍藥學學報，2003，19(1):74-76.