雙黃連注射液的氣相色譜指紋圖譜及其化學成分的相關性分析

茹 鑫， 梁 悅， 于 翠， 張寒琦， 師宇華

(吉林大學化學學院，吉林長春130012)

雙黃連注射液收載于衛生部部頒標準第十一冊，由金銀花250g、黃芩250g和連翹500g組成，為棕紅色澄明液體。有抗菌消炎，清熱解毒之功效，適用于球菌的各種感染。處方中金銀花、連翹、黃芩性寒味苦，含有揮發性成分。現代藥理學研究表明，這些揮發性成分具有解熱、抗菌的作用［1］，應加以利用。

目前雙黃連制劑的研究多以高效液相色譜法對其主要藥效成分分析為主。如張潔等［2］和馬百平等［3］采用HPLCPDA(二極管陣列檢測器)/ELSD(蒸發光散射)檢測器，將雙黃連粉針的指紋圖譜與各組成單味藥的指紋圖譜進行比較分析，并進行了各峰的藥味歸屬及定性。羅奇志等［4］采用液相色譜-質譜方法快速、全面地分析了雙黃連粉針中的成分，為雙黃連粉針的二次開發提供參考。李方等［5］建立了注射用雙黃連(凍干)的液相色譜指紋圖譜，用于該藥生產過程的質量控制和評價。劉琳等［6］采用采用多波長反相-高效液相色譜法建立了同時測定雙黃連口服液中黃芩苷、綠原酸和連翹苷的分析方法。此外，孫妍［7］和林林等［8］采用石墨爐原子吸收分光光度法分別檢測了雙黃連注射液中鎘和鉛元素，通過檢測有害金屬的含量控制雙黃連注射液的安全性。馬滿玲等［9］采用紫外光譜法對雙黃連注射液的穩定性進行了研究。中藥制劑的成分具有復雜性，采用一種方法進行分析難以實現整體的質量控制，實現藥品的安全和可靠。因此，為全面反映藥品整體的質量狀況，有必要對其中多組分、多指標進行分析和研究。目前，對雙黃連注射液揮發性成分的研究少有報道。為有效控制雙黃連注射液中揮發性成分的質量，針對制劑所含揮發性成分的特性，參照國家藥品監督管理局頒布的中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求［10］，對雙黃連注射液中揮發性成分的提取和檢測條件進行了考察和方法學驗證。利用中藥色譜相似度評價軟件建立了雙黃連注射液的GC對照譜圖并與各組成單味藥進行了對比和相關性分析，為雙黃連注射液的質量控制和進一步研發提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

HD揮發油提取器;DHT型攪拌恒溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);Varian CP-3800氣相色譜儀;SPB-3全自動空氣源(北京中惠普分析技術研究所);GCN1300氮氣發生器(北京中惠普分析技術研究所);SGH-300高純氫氣發生器(北京東方精華苑科技有限公司);FID檢測器;Star 5.0色譜工作站;島津QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀;雙黃連注射液(黑龍江多多藥業有限責任公司，市售10批次);正十二烷(色標，天津市光復精細化工研究所);正己烷為(分析純，北京化工廠);實驗用水為二次蒸餾用水。

1.2 實驗步驟

1.2.1 參照物溶液的制備

精密量取正十二烷50 μL，置于5 mL量瓶中，加入適量正己烷定容，作為參照物溶液。以正十二烷為標準參照物，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。

1.2.2 供試品溶液的制備

準確量取雙黃連注射液180 mL，置500 mL圓底燒瓶中，參照《中華人民共和國藥典》2005年版一部附錄XD揮發油測定法［11］，加熱回流提取8 h。停止加熱后，收集揮發油。加入10 μL參照物溶液，混勻、定容至0.3 mL，密封置于4℃冰箱中保存，作為供試品溶液。

1.3 氣相色譜及質譜實驗條件

1.3.1 氣相色譜條件

進樣量:0.5 μL，不分流進樣;進樣口溫度:280℃;FID檢測器溫度:280 ℃;色譜柱:DB-5MS(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);柱溫:程序升溫，初始溫度50℃保持10 min，以5℃/min升至70℃后，以2℃/min升至100℃，再以10℃/min升至250℃保持10 min;載氣:高純氮氣，流量:1.0 mL/min;燃燒氣:高純氫氣，流量:30 mL/min;助燃氣:空氣，流量:300 mL/min。

1.3.2 氣相色譜-質譜條件

進樣量:0.5 μL，分流比為50∶1;進樣口溫度:280℃;色譜柱:Rxi-5MS(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);柱溫:同氣相色譜柱溫條件;載氣:氦氣，流速:1 mL/min。電子轟擊源:離子源溫度200℃，電子能量70 eV;掃描范圍:50～450 amu;接口溫度:250℃;倍增電壓:1.2 kV;閾值:1 000 V;溶劑切除時間:3 min;結束時間:54 min。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗

將批號為080913311的樣品制成供試品溶液，連續進樣6次。結果表明:譜圖中各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜研究的技術要求。

2.1.2 穩定性試驗

將批號為080302311的樣品制成供試品溶液，分別于10 min、3、9、12、18、24 和 48 h 進行測定。結果表明:譜圖中各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在48 h內穩定，符合指紋圖譜研究的技術要求。

2.1.3 重復性試驗

將6份批號為090213311的樣品分別制備成供試品溶液并進行測定。結果表明:譜圖中各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD小于3%，表明供試品溶液的制備方法及儀器性能可靠，符合指紋圖譜研究的技術要求。

2.2 雙黃連注射液標準氣相色譜指紋圖譜和標準對照譜圖的建立

圖1 雙黃連注射液的氣相色譜指紋圖譜A;雙黃連注射液的標準對照譜圖BFig.1 A-GC fingerprint and B-Standard referenced GC fingerprint of Shuanghuanglian Injection

取10批次雙黃連注射液，分別按1.2.2項供試品溶液的制備方法和1.3.1項的色譜條件對供試品溶液進行制備和檢測，建立了雙黃連注射液的氣相色譜指紋圖譜。采用浙江大學中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統首次生成了雙黃連注射液的標準對照譜圖，標示出15個共有峰(見圖1，其中圖 1A中 1～10分別為批號 080705322、090213311、090206311、080731312、080913311、090424311、080302311、080116312、080901322、080730322 的色譜圖，S 為參照物十二烷的峰，R為生成的標準對照譜圖;圖1B為放大的標準對照譜圖，其中1～15為15個共有峰，S為參照物十二烷的峰)。10批次樣品中各共有峰的峰面積、相對保留時間RSD、相對峰面積RSD以及生成的標準對照譜圖的保留時間和峰面積的數據見表1。10批次樣品相似度的評價結果見表2。

表1 雙黃連注射液氣相色譜指紋圖譜和標準對照譜圖的實驗數據Table.1 Experiment result of basic and standard referenced GC fingerprint of Shuanghuanglian Injection

從10批次指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積的RSD可以看出:相對保留時間的RSD在0.04～0.72之間，均小于3%;相對峰面積的RSD在0.20～2.80之間(7號色譜峰除外，為3.25%)，均小于3%，各色譜峰相對峰面積存在一些差異，可能為所用的原料產地和季節性不同或儲藏方面存在差異造成的。

表2 相似度評價的結果Table.2 Result of similarity evaluation

利用中藥指紋圖譜相似度計算軟件，以10批次雙黃連注射液的指紋圖譜綜合平均作為對照模板，計算10批次樣品的相似度。從相似度評價的結果可以看出:相似度均大于0.87，說明該廠家不同批次的雙黃連注射液在整體上具有一定的相似性。

2.3 雙黃連注射液中揮發性成分的定性及其相關性分析

分別按1.2.2項供試品溶液的制備方法和1.3.2項的氣相色譜-質譜條件對供試品溶液進行制備和檢測。對比雙黃連注射液及其各單味藥材中各揮發性成分GC-MS分析的結果，對各主要色譜峰進行了定性和相關性分析。雙黃連注射液的總離子流圖見圖2，定性和歸屬分析的結果見表3。共檢測出雙黃連注射液中96個揮發性成分，按照各色譜峰的相對保留時間和保留值規律［12］、計算機數據庫檢索以及結合文獻報道［13-15］鑒定了其中的54個成分，占總峰面積的92.12%。其中芳香族化合物為揮發油的主要成分(占78.11%)，另外還有萜類(8.39%)和脂肪族化合物(5.62%)。對其相關性分析的研究結果表明:對于相對含量較高的化學成分都能從各單味藥材的譜圖中找到歸屬，細化了中藥制劑的質量控制指標。歸屬的43個化合物占已鑒定成分峰面積百分含量的84.27%;未歸屬的11個化合物中含量最大的是8號色譜峰(水楊酸甲酯)，疑是加工過程中的輔料。

圖2 雙黃連注射液的總離子流色譜圖Fig.2 TIC chromatogram of Shuanghuanglian Injection

表3 雙黃連注射液的化學成分及其相關性分析Table.3 Chemical components and their correlation analysis of Shuanghuanglian Injection

續表3

3 結論

利用中藥指紋圖譜相似度評價軟件，以10批次雙黃連注射液的指紋圖譜綜合平均生成的標準對照譜圖作為模板，計算了10批次樣品的相似度。研究結果表明:相似度在0.87～0.99，均大于0.85，說明該廠家不同批次雙黃連注射液的質量基本穩定。但是不同的批號在含量上存在著一定差異，提示生產工藝或所用原料存在來源不穩定問題，中藥必須在固定原藥材產地及提取工藝的前提下，才能保證中藥注射液的質量穩定可控。標準對照指紋圖譜的生成以及相似度評價使結果具有客觀性，避免了人為的誤差，從總體上較全面反映該制劑中揮發性成分的信息;結合各色譜峰的定性和相關性分析的結果可為雙黃連注射液的嚴格質量控制和進一步研發提供依據。

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