芪蛭皺肺無糖顆粒對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型小氣道重塑的影響

李金田， 梁 晶， 田永衍， 劉永琦， 李 娟， 任紅艷， 張 騫， 張 毅

(甘肅中醫學院，甘肅蘭州730000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病，該病氣流受限不完全可逆并呈進行性發展，同時因有害顆粒和氣體的吸入而致肺部炎癥［1］。本病屬中醫學咳嗽、喘證、哮證、肺脹等范疇［2，3］。COPD 由于其患病人數多，死亡率高，社會經濟負擔重，已成為一個重要的公共衛生問題，受到世界各國的重視。目前的西醫治療雖能有效緩解癥狀和并發癥，但仍沒有藥物能夠有效控制COPD肺功能進行性下降。中醫中藥治療COPD則有著十分廣闊的前景，本研究通過對COPD模型大鼠肺組織病理切片MASSON染色的觀察，采用放射免疫分析法對其支氣管肺泡灌洗液(BALF)以及血清中層黏連蛋白(LN)和透明質酸(HA)的測定，以探討芪蛭皺肺無糖顆粒對COPD小氣道重塑的影響。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物

健康SPF級Wistar大鼠60只，♀♂各半，體重(200±20)g，由甘肅中醫學院科研實驗中心提供(動物質量合格證編號:SCXK(甘)2004-0006-0000005)。

1.2 飼養環境

動物室為SPF級，環境溫度(23±3)℃，相對濕度30% ～40%，日光燈采光。清潔級飼料喂養，經高壓消毒處理，均由甘肅中醫學院SPF級實驗動物中心提供。

1.3 受試藥物

按體表面積折算率換算成大鼠等效劑量。

治療藥物:芪蛭皺肺無糖顆粒(由黃芪、水蛭、黨參、丹參、麥冬、五味子、枳實等按一定比例組成，由甘肅中醫學院藥物制劑教研室提供);對照藥物:固本咳喘片(臺州南峰藥業有限公司，生產批號:070504)。

1.4 主要試劑

蘭州牌香煙(焦油量:12 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，煙氣一氧化碳量13 mg):甘肅·蘭州卷煙廠;脂多糖(LPS)，10 mg/支，Sigma公司，生產批號:L-2880;烏拉坦:中國醫藥集團上海化學試劑公司;LN放免試劑盒:購于北京科美東雅生物技術有限公司，生產批號:20080825;HA放免試劑盒:購于北京科美東雅生物技術有限公司，生產批號:20080825。

1.5 主要儀器

AE200電子分析天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司);GC-9111型放射免疫γ計數器(科大創新股份有限公司中佳分公司);KDC-2044低速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司);恒溫水浴箱:上海醫療器械七廠;光學顯微鏡:德國。型號:CX31-32L02;石蠟切片機:德國。型號:RM2135;石蠟包埋機:日本。型號:TEC-VEM-J2;石蠟脫水機:日本。型號:VIP-5JR-J2。

2 方法

2.1 動物分組

實驗動物適應性飼養3 d后，按隨機數字表法分為:空白對照組、模型組、陽性藥物對照組、芪蛭皺肺無糖顆粒小劑量組、芪蛭皺肺無糖顆粒中劑量組、芪蛭皺肺無糖顆粒大劑量組。每組10只，雌雄各半。

2.2 慢性阻塞性肺疾病模型制備

采用宋一平等［4］的方法并加以改良建立慢性阻塞性肺疾病模型大鼠。①在正常的室溫環境中，第1、14天將大鼠麻醉后氣管內滴入LPS:大鼠逐一稱重，按5 mL/kg體重的比例，腹腔注射濃度為20%的烏拉坦溶液，大鼠麻醉后，將其固定于解剖臺上，且采用頭低位暴露聲門，行氣管插管后，快速注入溶于注射用生理鹽水的濃度為1 mg/mL的LPS 0.2 mL，將大鼠直立，左右旋轉，使LPS在兩側肺內均勻分布，后置于安靜處，待其自然清醒后置籠內常規飼養。② 第2～28天(滴LPS當天不煙熏)給予大鼠每天一次香煙煙熏，每只大鼠一支煙，持續時間大約1/2 h。被動吸煙方法:將大鼠放入自制的容積為48 L的玻璃染毒箱(箱底兩側各有直徑3 cm的進煙孔，箱蓋中央有一直徑3 cm的通氣孔)內，香煙點燃后，進行大鼠被動吸煙染毒。為減少香煙燃燒所產的水蒸氣對大鼠的影響，在箱底放置適量硅膠干燥劑。

2.3 藥物治療

從第15天起，空白對照組、模型組給予中劑量顆粒輔料溶液3 mL灌胃;陽性藥物對照組給予固本咳喘片溶液3 mL［相當于成藥0.324 g/(kg·d)］灌胃治療;芪蛭大劑量組［相當于生藥2.16 g/(kg·d)］;芪蛭中劑量組［相當于生藥1.08 g/(kg·d)］;芪蛭小劑量組［相當于生藥0.54 g/(kg·d)］均給予芪蛭皺肺無糖顆粒溶液3 mL灌胃治療。每日1次，連續灌胃28 d，所有動物均飼養42 d。實驗藥物的劑量換算:在對大鼠進行灌胃時，治療藥物和對照藥物用量均按體表面積比率換算法(D2=D1×0.018×5)配制藥液，臨床等效劑量為實驗的中劑量。

2.4 樣本采集及制作

濃度為20%烏拉坦溶液，按5 mL/kg體重腹腔內注射麻醉大鼠，經股動脈采血，離心取血清約為1 mL，處死大鼠，分離肺臟，夾閉右肺，用3 mL生理鹽水灌洗左側肺臟，反復2次，回收量約為4 mL，離心，取上清液1 mL，同血清一起置于-20℃冰箱待測。用放免法檢測BALF以及血清中LN和HA水平(按試劑盒說明書操作)。然后松開右肺，夾閉左側肺臟，摘取右肺下葉，用4%多聚甲醛溶液固定一周，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，切片，MASSON染色，光鏡下觀察組織形態學改變。

3 統計學分析

結 果

1 病理組織學所見

肺組織切片經MASSON染色后顯示(鏡下觀察):膠原纖維呈現淡藍色，肌肉、胞漿呈現紅色，胞核呈現藍黑色。空白對照組:可見中、末支氣管壁有較薄的膠原層，肺泡區有少量的膠原。模型組:支氣管壁、肺間質、肺泡隔呈現膠原纖維明顯增多，支氣管周圍膠原增生明顯，并向肺間質延伸并且沉積。芪蛭小劑量組:中、末支氣管壁、肺泡隔、肺間質呈現膠原纖維沉積，但與模型組相比為少，兩組差異不明顯。芪蛭中劑量組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質呈現膠原纖維沉積，但與模型組相比明顯減少，兩組差異較為顯著。芪蛭大劑量組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質呈現膠原纖維與模型組相比為最少。陽性對照組:支氣管壁、肺泡隔、肺間質呈現膠原纖維較模型組明顯減少。

2 各組大鼠肺組織MASSON染色膠原平均面積的比較(見表1)

表1 各組大鼠肺組織MASSON染色膠原平均面積(±s)

表1 各組大鼠肺組織MASSON染色膠原平均面積(±s)

注:與空白對照組比較，▲▲P＜0.01;與 COPD模型組比較，●●P＜0.01;與陽性藥物對照組比較，＆P＜0.05。

組別 例數/個 膠原平均面積/×104μm2空白對照組10 3.58±1.58模型組 8 21.14±6.33▲▲芪蛭小劑量組 8 10.41±3.90●●＆芪蛭中劑量組 9 5.11±2.65●●芪蛭大劑量組 9 5.57±3.50●●陽性對照組 9 6.00±3.28●●

結果顯示:與空白對照組相比，模型組肺膠原平均面積顯著升高，P＜0.01。與COPD模型組相比，芪蛭小、中、大劑量、陽性對照組肺膠原平均面積顯著下降，P＜0.01。與陽性對照組相比，芪蛭小劑量組肺膠原平均面積明顯下降，P＜0.05。

3 各組大鼠BALF中HA、LN含量的比較(見表2)

表2 各組大鼠BALF中LN、HA的含量(±s)

表2 各組大鼠BALF中LN、HA的含量(±s)

注:與空白對照組比較，▲▲P＜0.01;與COPD模型組比較，●P＜0.05，●●P ＜0.01;與陽性藥物對照組比較，＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01。

組別 例數/個 LN/(μg/L) HA/(μg/L)空白對照組10 20.54±4.43 26.28±6.61模型組 8 33.86±5.90▲▲ 86.37±15.29▲▲芪蛭小劑量組 8 28.73±7.10 75.50±11.57芪蛭中劑量組 9 24.52±7.53●● 47.60±11.09●●＆＆芪蛭大劑量組 9 20.84±6.20●●＆ 38.58±4.52●●＆＆陽性對照組 9 27.19±4.35● 69.48±16.33●●

結果顯示，模型組BALF中LN、HA含量與空白對照組相比顯著升高，P＜0.01。芪蛭中、大劑量組BALF中LN、HA含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01。陽性對照組BALF中LN含量與模型組相比明顯下降，P＜0.05。陽性對照組BALF中HA含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01。芪蛭大劑量組BALF中LN含量與陽性對照組相比明顯下降，P＜0.05。芪蛭中、大劑量組BALF中HA含量與陽性對照組相比顯著下降，P＜0.01。

4 各組大鼠血清中HA、LN含量的比較(見表3)

表3 各組大鼠血清中LN、HA的含量(±s)

表3 各組大鼠血清中LN、HA的含量(±s)

注:與空白對照組比較，▲▲P＜0.01;與COPD模型組比較，●P＜0.05，●●P ＜0.01;與陽性藥物對照組比較，＆P ＜0.05，＆＆P ＜0.01。

組別 例數 LN/(μg/L) HA/(μg/L)空白對照組10 25.76±3.87 293.48±60.89模型組 8 41.06±8.79▲▲ 483.05±64.24▲▲芪蛭小劑量組 8 34.08±5.63● 415.47±93.66＆＆芪蛭中劑量組 9 31.39±5.71●● 389.57±89.21●＆芪蛭大劑量組 9 28.36±6.44●● 320.38±48.29●●陽性對照組 9 34.04±7.71● 312.25±68.18●●

結果顯示，模型組血清中LN、HA含量與空白對照組相比顯著升高，P＜0.01。芪蛭小劑量組血清中LN含量與模型組相比明顯下降，P＜0.05。芪蛭中劑量組血清中LN含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01，HA含量與模型組相比明顯下降，P＜0.05。芪蛭大劑量組血清中LN、HA含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01。陽性對照組血清中LN含量與模型組相比明顯下降，P＜0.05，HA含量與模型組相比顯著下降，P＜0.01。芪蛭小劑量組血清中HA含量與陽性對照組相比顯著升高，P＜0.01。芪蛭中劑量組血清中HA含量與陽性對照組相比明顯升高，P ＜0.05。

討 論

在COPD發生、發展的過程中，導致肺組織內部小氣道重塑的原因是多方面的，其中肺內的細胞外基質(ECM)主要成分膠原蛋白、蛋白多糖及黏連糖蛋白是支氣管肺組織的炎癥、損傷、修復、重塑的重要原因，是COPD不斷發展的病理基礎。

膠原蛋白是ECM的主要成分，肺臟的膠原成分是維持肺臟結構的完整性、間隔性和具有容積功能的基礎。膠原分布于肺結締組織網的各個部位。I型和Ⅲ型膠原是肺間質的主要纖維成分，因此膠原在肺臟沉積與降解速度之間的平衡狀態，對于維持肺臟的正常結構與功能具有十分關鍵性的作用。通過對病理觀察，可以明顯看到芪蛭大劑量組膠原減少最為顯著，中劑量組膠原平均面積為最少。

LN是存在于ECM中的一種糖蛋白，且與膠原一同構成基底膜骨架，對ECM的代謝起著極為重要的調節作用。研究表明，LN具有刺激細胞遷移、黏附、分化和生長等豐富的生物學活性，在肺組織纖維化病變進展中具有非常重要的作用［5］;LN的增多可以使炎性細胞數量增多，同時積聚于基底膜，導致肺組織纖維化［6］;LN的增多還提示上皮細胞出現損傷、破壞，不斷有新的細胞生長，增生和修復，導致上皮增厚［7］。本實驗結果顯示芪蛭大、中劑量組大鼠BALF以及血清中LN含量同模型組相比顯著降低，其中在BALF中芪蛭大劑量組與陽性藥物組相比有明顯差異，且作用要優于中劑量組和陽性組。說明大劑量芪蛭皺肺無糖顆粒在對COPD大鼠肺組織LN的代謝、肺臟纖維化和小氣道的重塑方面，發揮著重要的作用。

HA是ECM中糖胺聚糖的主要成分。已經有研究指出 HA與很多肺臟疾患的發生有關［5］，是COPD敏感的炎癥標志物［8］，還參與膠原纖維的合成作用，能使靜止的纖維細胞活化，形成具有合成和分泌膠原蛋白功能的成纖維細胞。而肺成纖維細胞的活化、增殖以及通過釋放介質使肺內ECM產生增多，因此，HA在肺纖維化發病機制中起決定性作用。實驗結果顯示芪蛭中劑量組、大劑量組、陽性組大鼠BALF中HA含量比模型組顯著降低;芪蛭中、大劑量組同陽性藥物組相比有顯著性差異;其中大劑量組的作用要優于中劑量組。這一結果說明大劑量芪蛭皺肺無糖顆粒可明顯干預COPD大鼠肺臟HA的代謝，進而影響COPD肺組織纖維化和小氣道的重塑。

COPD的病因不外乎外感與內傷。肺系病易虛易實，結合本病的特點，可以概括為肺脾腎虛、痰瘀阻肺。肺、脾、腎三臟之虛是COPD反復發作的重要內因，血瘀貫穿慢性阻塞性肺疾病始終，是其重要的病理改變。芪蛭皺肺無糖顆粒，方中黃芪為補肺氣要藥，補氣以助血行;水蛭破血逐瘀，消散肺中瘀血，共為君藥;黨參健脾益肺，既助黃芪補肺氣，又擅補脾氣而培土生金;丹參既補血又活血，使補而不滯，活而不傷，均為臣藥。五味子斂肺滋腎，麥冬以養陰潤肺，既收耗散之肺氣，又潤虛損之肺陰;枳實開肺脾之氣而消痞脹，化痰飲，俱為佐藥。諸藥合用，標本兼治，虛實共調，有益氣培元，化痰活血，癟皺肺脹之功效。本實驗結果顯示，芪蛭皺肺無糖顆粒可以緩解肺內細支氣管、終末細支氣管管腔及周圍膠原纖維的浸潤和分泌物阻塞，恢復纖毛黏連、倒伏、脫落，且芪蛭大劑量組大鼠BALF以及血清中HA以及LN含量較模型組明顯降低，芪蛭中劑量組膠原平均面積最小為各組中最小。結合其病理特點，說明芪蛭皺肺無糖顆粒通過補氣活血通絡的方法，在COPD進行性加重過程中，對小氣道重塑具有重要的干預作用。

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