不同產(chǎn)地龍膽中環(huán)烯醚萜類成分的含量測定

王立明

(山東省泰安長城中學(xué)，山東泰安271000)

龍膽(Radix et Rhizoma Gentianae)，又名龍膽草，因其“葉如龍葵，味苦如膽”而得名。為龍膽科植物條葉龍膽(Gentiana manshurica Kitag)、龍膽(Gentiana scabra Bge)、三花龍膽(Gentiana triflora pall)或堅(jiān)龍膽(Gentiana rigescens Franch)的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，性寒，味苦，入肝、膽經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效［1］，是中醫(yī)治療肝膽疾病的常用藥之一。在臨床上，龍膽是龍膽瀉肝湯、當(dāng)歸龍薈丸、瀉青丸等方劑的主藥，在我國南北各地均有分布。

龍膽中的主要化學(xué)成分包括裂環(huán)環(huán)烯醚萜及其苷類、生物堿、三萜類、黃酮類等化合物，其中環(huán)烯醚萜苷類成分是其中含量最大、活性最強(qiáng)的部分，包括龍膽苦苷(gentiopicroside，GTP)、獐牙菜苦苷(Swertiamarian，SWT)、獐牙菜苷(Sweroside，SWS)［2-3］。目前主要通過測定藥材中龍膽苦苷的含量來控制藥材的質(zhì)量，但只用龍膽苦苷作為指標(biāo)難以反應(yīng)出藥材中其它環(huán)烯醚萜苷類成分的含量及龍膽藥材的質(zhì)量。本試驗(yàn)分別建立了紫外法測定龍膽藥材中環(huán)烯醚萜總苷類成分含量和HPLC法測定3種環(huán)烯醚萜苷類成分含量的方法，并對(duì)21種不同產(chǎn)地的龍膽藥材質(zhì)量進(jìn)行了比較，從而為龍膽藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2401 PC型紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU，Japan);Agilent 1 100型高效液相色譜儀(Agilent Technologies，USA);KUDOS SK5200LH 超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);DJ-04型粉碎機(jī)(上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司);BS224S型電子分析天平(Sartorius，Germany)。

龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)110770-200510)和獐牙菜苷對(duì)照品(批號(hào)111742-200501)均購自中國藥品生物制品檢定所，獐牙菜苦苷對(duì)照品購自江西本草天工科技有限公司，HPLC測定含量≧98%。

所用甲醇和乙腈均為色譜純(TEDIA，USA)，超純水(Millipore Simplicity?水純化系統(tǒng)，USA)，其余試劑均為分析純。

龍膽藥材收集于全國不同地區(qū)，詳見表4。藥材經(jīng)復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院侯愛君教授鑒定，均為龍膽科植物條葉龍膽(Gentiana manshurica Kitag)、龍膽(Gentiana scabra Bge)、或堅(jiān)龍膽(Gentiana rigescens Franch)的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外分光光度法測定龍膽總苷的含量

以龍膽苦苷為對(duì)照品，測定龍膽藥材中龍膽總苷的含量。

2.1.1 對(duì)照品溶液與供試品溶液的制備

精密稱取經(jīng)減壓干燥的GTP對(duì)照品9.90 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液;取龍膽藥材粉末(40目)約200 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇50 mL，密塞，精密稱定，超聲提取30 min，放冷，而后用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液。

2.1.2 吸收波長的確定

供試品與對(duì)照品溶液均以甲醇溶液為空白對(duì)照在200～400 nm波長處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)二者均在206 nm和270 nm處有吸收峰，且在270 nm處為最大吸收，樣品溶液在270 nm處樣品吸收干擾較小，故選擇270 nm作為測定波長。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

精密吸取對(duì)照品溶液 0.4，1.0，2.0，3.0，4.0 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。以甲醇為空白，于270 nm波長處測定吸收度值A(chǔ)，以A對(duì)濃度C作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.024 8C-0.004 1(r=0.999 9)，表明在 3.96 ～39.6 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，連續(xù)測定6次，計(jì)算 RSD為0.38%。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批龍膽藥材粉末(40目)6份，每份約200 mg，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)的RSD為1.36%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液在室溫下放置，分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測定，計(jì)算測定結(jié)果的 RSD 值，為0.86%，表明供試品溶液在室溫放置2 d穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批已知含量的龍膽藥材粉末(40目)9份，每份約100 mg，置于具塞錐形瓶中，分別精密定量加入GTP對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定含量，計(jì)算高、中、低3種質(zhì)量濃度的平均回收率及RSD，結(jié)果見表1。

表1 龍膽總苷測定的加樣回收率測定結(jié)果

2.1.8 不同產(chǎn)地藥材中的含量測定

取21批不同產(chǎn)地的龍膽藥材樣品，按2.1.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，并進(jìn)行測定。測定結(jié)果見表4。

2.2 HPLC法測定龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷的含量［7］

2.2.1 對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備

精密稱取龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和樟芽菜苷對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液，其中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷的濃度分別約為600、10和10 μg/mL。

取龍膽藥材粉末(40目)約300 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇50 mL，密塞，精密稱定，超聲提取30 min，放冷，而后用80%的甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱:Agela Venusil XBP-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)，保護(hù)柱:Securityguard-C18(5 μm，4.0 mm×2.0 mm);流動(dòng)相:甲醇-水(17∶83);流速:1 mL/min，柱溫:30℃;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測波長:254 nm。

分別精密吸取10 μL對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，如圖1所示，SWT、GTP和SWS的保留時(shí)間分別約為18、24和30 min，與其他組分分離較好(R＞1.5)，理論塔板數(shù)按龍膽苦苷計(jì)算應(yīng)在5 000以上。

圖1 龍膽藥材及標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

精密吸取混合對(duì)照品貯備液各 10、5、2.5、1、0.4 mL，分別置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。分別取上述系列濃度的溶液及混合對(duì)照品貯備液各10 μL，注入液相色譜儀測定各成分的色譜峰面積。將色譜峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作線性回歸，結(jié)果見表2。各指標(biāo)成分在測定濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表2 龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷HPLC測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.2.4 精密度試驗(yàn)

分別吸取高、中、低3種濃度的對(duì)照品溶液，測定并計(jì)算其日內(nèi)與日間精密度，日內(nèi)精密度每份樣品進(jìn)樣5次，日間精密度每份樣品每天測定1次，連續(xù)5 d。結(jié)果GTP、SWT和SWS的日內(nèi)精密度RSD(n=15)分別為0.76%、0.90%和0.91%，日間精密度RSD(n=15)分別為1.10%、1.24%和1.56%。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次龍膽藥材5份，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣并計(jì)算含量。結(jié)果3種組分的RSD分別為1.42%、1.03%和1.67%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液在室溫下放置，分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣分析并計(jì)算含量。結(jié)果獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐芽菜苷的RSD分別是0.859%、0.783%和1.296%，表明供試品溶液室溫下2 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品，共9份，分別精密加入GTP、SWS及SWT對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定含量，計(jì)算高、中、低3種質(zhì)量濃度的平均回收率及RSD，結(jié)果見表3。

表3 龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和樟芽菜苷HPLC測定的加樣回收率(n=3)

2.2.8 不同產(chǎn)地龍膽樣品的含量測定

取21批不同產(chǎn)地的龍膽藥材樣品，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，按外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算GTP、SWS和SWT的含量，結(jié)果見表4。

3 討論

龍膽苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷是龍膽中裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物的指標(biāo)性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，紫外光譜的最大吸收波長分別為270、230和235 nm。為方便進(jìn)行測定，參考相關(guān)文獻(xiàn)［4］，故本實(shí)驗(yàn)選擇254 nm為檢測波長，方法學(xué)研究結(jié)果顯示，均符合要求，可以滿足同時(shí)測定3種成分的要求，效果良好。

表4 不同產(chǎn)地龍膽藥材中龍膽總苷及3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)(n=3)

由于受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán)境等差異的影響，僅針對(duì)中藥材或其提取物的某個(gè)有效成分進(jìn)行定性、定量分析，并不能有效控制其質(zhì)量。指紋圖譜是一種較好的質(zhì)量控制方法，可以提供較穩(wěn)全面的信息，但不同產(chǎn)地之間的藥材差異較大。因此，對(duì)已知的有效部位和更多的有效成分進(jìn)行含量控制，就成為一種控制與評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的可行而合理的方法。本試驗(yàn)選擇龍膽中的有效部位環(huán)烯醚萜苷類及其中3種已知成分作為指標(biāo)，與現(xiàn)有的只測定龍膽苦苷的含量比較，可以更全面的反映出龍膽藥材的質(zhì)量。研究結(jié)果顯示，樣品的前處理和測定方法簡便、可行。

《中國藥典》2005年版(一部)規(guī)定，龍膽藥材中龍膽苦苷的含量不得少于1.0%。從測定結(jié)果看，21種不同產(chǎn)地的龍膽藥材中，只有4種達(dá)不到此要求，約占總數(shù)的20%。但不同產(chǎn)地藥材中有效部位及3種有效成分的含量差異較大，東北產(chǎn)龍膽中環(huán)烯醚萜苷類成分的含量相對(duì)較高，這與張建生［4］等人的測定結(jié)果基本一致。而且，另外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)龍膽苦苷與龍膽總苷含量的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)二者具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.985 8，說明通過測定藥材中龍膽苦苷的含量可以在一定程度上反映出龍膽總苷的含量，說明了以龍膽苦苷作為龍膽藥材質(zhì)量控制指標(biāo)的合理性。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:64-65.

［2］劉 濤，才 謙，付玉芹.中藥龍膽的研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2004，31(1):85-86.

［3］劉 濤，付玉芹，才 謙，等.龍膽總裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，29(2):25-27.

［4］張建生，田子新，樓之芩.九種龍膽中五種裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類苦味成分的高效液相色譜定量分析［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1991，26(11):864-870.