一種快速的leptinob和leptinrdb等位基因SNP分型方法

胡培麗,王金恒,岳秉飛

（中國藥品生物制品檢定所,北京 100050）

一種快速的leptinob和leptinrdb等位基因SNP分型方法

胡培麗,王金恒,岳秉飛

（中國藥品生物制品檢定所,北京 100050）

目的建立leptinob和leptinrdb等位基因的SNP分型方法-單管雙向等位基因專一性擴增（single-tube bi-directional allele specific amp lification,SB-ASA）,同時與傳統的PCR-酶切法進行比較分析。方法用PCR-酶切法和SB-ASA方法同時對ob/+雜合小鼠的7只后代小鼠和db/m的9只后代小鼠進行了檢測分型。結果兩種方法都成功地對ob、db小鼠進行了分型,且結果完全一致。結論成功建立了一種快速的leptinob和leptinrdb等位基因的SNP分型方法-SB-ASA,促進了ob、db小鼠的繁殖育種工作。

ob；db；SNP；單管雙向等位基因專一性擴增；小鼠

瘦素（lep tin）是一種由167個氨基酸殘基組成,分子質量16 000道爾頓的蛋白質激素,主要在白色脂肪細胞中表達,與細胞表面受體結合引發各種生理反應。瘦素通過與下丘腦相關的反饋環實現調節攝食、能量消耗及維持體重恒定。1994年,Zhang等[1]克隆了人和小鼠的肥胖基因（obese gene,ob gene）,其編碼產物即為瘦素。ob/ob小鼠由于其ob基因在第105位發生由C→T的突變,使該位點的精氨酸密碼子CGA轉變為終止密碼子TGA。這種突變使ob基因表達產物活性喪失,所以表現為肥胖。ob/ob小鼠廣泛應用于肥胖癥和糖尿病研究,是整個Jackson實驗室中應用最多的肥胖動物模型,還廣泛應用于營養學和藥理學研究中的肥胖癥和糖尿病治療[2]。

1966年Humm el等[3]發現與ob/ob小鼠表型相似的db/db小鼠,30年后被證實是因為編碼瘦素受體（lep tin recep tor,LR或ob-R）的糖尿病基因（d iabetes gene,db gene）胞內區外顯子內一個G→T的點突變,而轉錄成胞內部分較短的無功能LR產物,失去將信號傳至胞內的作用,表現為嚴重肥胖、瘦素抵抗、高瘦素血癥、胰島素抵抗和家族性糖尿病等[4-6]。db/db小鼠是 Lep tin受體基因缺陷導致的先天肥胖性 2型糖尿病小鼠,具有高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特性。其發病過程與人 2型糖尿病腎病非常相似,是國際上廣為采用的研究糖尿病腎病的動物模型[7,8]。

目前,Jackson實驗室野生型和突變型等位基因的分型方法主要是用限制性內切酶消化基因組DNA的 PCR擴增產物,然后瓊脂糖凝膠電泳鑒別[9,10]。該方法需長時間的酶切過程,整個過程約需 12 h,其中手工操作約有 1 h。本文我們用 PCR-酶切法和已成功建立的 SNP分型方法——單管雙向等位基因專一性擴增[11](single-tube bi-directional allele specific amp lification,SB-ASA)檢測leptinob和leptinrdb等位基因,并對該兩種方法進行比較分析,擬建立一種快速的leptinob和leptinrdb等位基因的SNP分型方法,從而有效促進 ob、db小鼠的繁殖育種工作。

1 材料和方法

1.1 動物來源、飼養及DNA樣品

B6.V-Lepob/+、B6.BKS(D)-Lep rdb/m雜合小鼠從南京模式動物研究所引進,合格證號：2002810。分籠飼養于無菌包中,自由攝食,飲水,近親交配,成功繁殖。ob、db代表肥胖和糖尿病基因, m代表淺色毛基因,ob/+、db/m型為糖尿病和肥胖基因攜帶者,其表型正常,產生的后代中,25%發生糖尿病和肥胖,即 ob/ob、db/db型糖尿病鼠;25%為野生型,未發生任何突變;50%為雜合子,可用于繁殖交配。小鼠出生約 4周時剪取尾巴 1 cm長左右,用酚：氯仿抽提法提取基因組DNA。

1.2 試劑

DNA聚合酶等 PCR試劑均購自 Takara(寶生物,大連),限制性內切酶D deⅠ和RsaⅠ,購自Prom ega公司。

1.3 PCR-酶切法鑒別lep tinob和lep tin rdb等位基因

B6.V-Lepob/J小鼠 ob基因第 105位密碼子處CGT→TGA單堿基突變,致使終止密碼子替代了正常編碼的精氨酸,基因組中的突變位點(C→T)形成DdeⅠ內切酶的酶切位點 (C^TNAG),分析其序列發現該位點兩端還有 2個 DdeⅠ酶切位點,兩端間距離為 155 bp,與 C/T突變點距離分別為 55 bp、100 bp。PCR擴增基因組DNA的這段目的基因片段 155 bp,引物序 列為IMR1151：5′-TgTCCAAgATgg ACCAgACTC-3′,IMR1152：5′-ACTggTCTgAgg CAgggAgCA-3′。PCR反應體系為：20μmo l/L引物0.4μL,10×PCR buffer 1.5μL、2.5 mmo l/L dNTP 1.0μL,5 U/μL DNATaq聚合酶 0.1μL、DNA模板10～50 ng,無菌超純水補充體積至 15μL。PCR反應程序為：94℃3m in,94℃30 s,62℃1 m in,72℃45 s,35個循環,72℃延伸 2m in,4℃保存。PCR產物目的片段155 bp再經DdeⅠ酶切,酶切體系為：10 ×buffer2.0μL,10μg/μL BSA 0.2μL,DdeⅠ0.5 μL,5.0μL PCR產物,無菌超純水補充體積至 20 μL;37℃,8 h。酶切產物經 3%凝膠電泳,根據條帶類型鑒別各小鼠表型。

B 6.BKS(D)-Lep rdb/J小鼠由于編碼瘦素受體的糖尿病基因 (diabetes gene,db gene)胞內區外顯子內發生 G→T點突變,設計引物時 SNP位點一端的第二位引入錯配堿基,形成 Rsa?酶切位點 (GT^ AC)。引物序列為IMR0985：5′-AgAACggACA CTCTTTgAAgTCTC-3′,IMR0986：5′-CATTCAAACC ATAgTTTAggTTTgTgT-3′(g為錯配堿基),擴增片段長度為 135 bp。PCR反應體系同上,反應程序為：94℃1.5m in,94℃30 s,52℃45 s,72℃45 s,35個循環,72℃延伸2m in,4℃保存。PCR產物目的片段135 bp再經 RsaⅠ酶切,酶切體系為：10×buffer2.0 μL,10μg/μL BSA 0.2μL,RsaⅠ0.5μL,5.0μL PCR產物,無菌超純水補充體積至 20μL;37℃,8 h。酶切產物經 3%凝膠電泳,根據條帶類型鑒別各小鼠表型。

1.4 SB-ASA方法檢測lep tinob和lep tin rdb等位基因

用已成功建立的單管雙向等位基因專一性擴增[11](single-tube bi-directional allele specific am p lification,SB-ASA)方法檢測糖尿病小鼠基因組DNA中的 SNP位點突變類型,從而確定各小鼠表型。引物 P1、P2擴增含 SNP突變位點的基因片段作為內對照,SNP1、SNP2為對應于不同等位基因的特異引物,3′末端對應于 SNP位點;為提高特異性,在其 3′端倒數第 3位引入錯配堿基。各擴增片段和引物序列見表1。PCR反應體系為：20μmo l/L P1 (P2)0.5μL,20μmo l/L SNP1(SNP2)0.75μL,10× PCR buffer2.5μL、2.5mmo l/L dNTP 2.0μL,5 U/ μL DNATaq HS酶 0.15μL、DNA模板 20～100 ng,無菌超純水補充體積至 25μL。PCR反應程序為：94℃ 4 m in,94℃ 45 s,退火溫度 (leptinob62℃,leptinrdb55.5℃）45 s,72℃2m in,30個循環,72℃延伸 5m in,4℃保存。PCR產物經 1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測,根據條帶類型判斷各小鼠表型。

表1 leptinob和leptinrdb等位基因SB-ASA分型的引物序列及擴增片段長度Tab.1 The p rim er sequences and amp lified fragm ent length of the leptinob and leptinrdb allele genotyped by SB-ASA.

2 結果

段落 true="1">

2.1 PCR

-

酶切法分型結果

ob/+雜合子交配產生的7只小鼠基因組DNA首先PCR擴增目的基因片段155 bp,再經DdeⅠ酶切,結果如圖1-A所示：1、3、4、5、6號目的片段155 bp部分被DdeⅠ酶切,形成155 bp、100 bp、55 bp三條電泳條帶,為ob/+雜合小鼠；2號目的片段未被DdeⅠ酶切,只有一條155 bp條帶,說明該鼠ob基因第105位密碼子沒有發生突變,為+/+野生小鼠；7號目的片段完全被DdeⅠ酶切,形成100 bp、55 bp兩條帶,為ob/ob突變小鼠。

db/m雜合子交配產生的9只小鼠因組DNA首先PCR擴增目的基因片段135 bp,再經RsaⅠ酶切,結果如圖1-B所示：1、2、6、7號目的基因片段135 bp部分被RsaⅠ酶切,形成135 bp、108 bp、27 bp（太小,在圖中看不見）條帶,為雜合型（db/m）；3、5、8號僅為135 bp條帶,目的片段未被酶切,為野生型（m/m）；4、9號只有108 bp酶切片段,為突變型（db/db）,還有一條酶切片段27 bp由于太小,在此圖中看不見。

2.2 SB-ASA方法分型結果

用 SB-ASA方法對7只ob/+雜合子后代和9只db/m后代小鼠進行了分型,結果見圖 2。目的條帶很清晰,雖然存在一些錯配雜帶,但不影響小鼠表型的鑒定。ob、db小鼠都擴增出 3條目的片段,即一條所有表型小鼠都有的片段,由引物P1、P2擴增而得,起內對照的作用；兩條特征片段,分別對應于不同的SNP位點等位基因,根據不同的特征片段確定各小鼠的表型。7只 ob/+雜合子后代的檢測結果為（圖2-A）：1、3、4、5、6號小鼠除了內對照片段 489 bp,擴增出兩條特征條帶191 bp和342 bp, SNP位點為 T/C,為雜合型；2號特征條帶為191bp,對應于等位基因 C,為野生型；7號的特征片段為342 bp,對應于等位基因 T,為突變型。9只db/m雜合子后代小鼠的檢測結果為 （圖2-B）：1、2、6、7號小鼠除內對照片段606 bp外,擴增出兩條特征片段,474 bp和 150 bp,對應于等位基因 T/C,為雜合型；3、5、8號小鼠的特征片段為 150 bp,對應于等位基因G,為野生型；4、9號小鼠的特征片段為474 bp,對應于等位基因T,為突變型。所有小鼠的分型結果與PCR-酶切法的結果一致,說明SB-ASA方法是準確的、可靠的。

圖1 leptinob和leptinrdb等位基因PCR-酶切法分型結果Note：M：20 bp DNA ladderm arker； Fig.1A：the genotyp ing resu ltsof seven offsp ringsof ob/+heterozygousm ice：1,3,4,5,6 w ere ob/+, 2 w as+/+,7 wasob/ob；Fig.1B：the geno typ ing resu ltsof nine offsp ringsof db/m heterozygousm ice：1,2,6,7 were db/m；3,5,8 w erem/ m；4,9 w ere db/db.F ig.1 The geno typ ing resu ltsof PCR-restriction endonuc lease d igestion fo r the leptinob and leptinrdb alleles

圖2 leptinob和leptinrdb等位基因SB-ASA方法分型結果Note：M：20 bp DNA ladderm arker； Fig.2A：the geno typ ing resu ltsof seven offsp ringsof ob/+heterozygousm ice：1,3,4,5,6 w ere ob/+,2 was+/+,7 w asob/ob； Fig.2B：the genotyp ing resu ltsof nine offsp ringsof db/m heterozygousm ice：1,2,6,7 were db/m；3,5,8 w erem/m； 4,9 were db/db.F ig.2 The geno typ ing resu ltsof SB-ASA fo r the leptinob and leptinrdb alleles

3 討論

PCR酶切法鑒定SNP位點等位基因是Jackson實驗室目前用于鑒別ob、db小鼠不同表型的方法。通過創造酶切位點法檢測單堿基突變,很多時候應考慮到限制性內切酶是否存在、是否易得、價格是否昂貴等問題,擴增的片段長度也不宜過長,而且片段間大小差距較小,瓊脂糖凝膠電泳鑒別時有些困難,一些片段太小以致看不見條帶。此外,酶切反應體系中PCR模板的量的優化也尤為重要,過多酶切不完全影響結果判定,過少電泳條帶太淺結果無法鑒別。

SB-ASA方法僅需一次PCR擴增和一次瓊脂糖凝膠電泳即可達到分型的目的。它快速、簡單而且成本低廉,是一項開展SNP分型研究的十分有效的方法。此方法在特異性引物的3′端區域人為引入一個錯配堿基,使得引物延伸的特異性大大提高,降低了SNP分析的假陽性率；同時在進行SNP分型時,采用熱啟動Taq酶和冰上操作,也可有效地控制假陽性現象。當然SB-ASA也有些不足：由于兩對引物同時加入PCR反應體系,擴增過程中會有雜帶產生,可通過優化退火溫度得到改善。

此外,還可以根據毛色和體型的差別鑒別不同表型的db小鼠,節約了大量的時間和成本,方便了繁殖育種工作。由于db代表肥胖和糖尿病基因,m代表淺色毛基因,db/db、db/m小鼠毛色均為黑色,但db/db小鼠在4周時已明顯肥胖,雜合子db/m可以根據體型很容易地挑選出來用于繁殖育種；而m/m野生型小鼠由于m代表淺色毛基因,毛色為灰色（m isty）。

[1] Zhang Y,Proenca R,M affel,M.etal.Positional cloning of the mouse obese gene and itshuman homologue[J].Nature,1994, 372：425-431.

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[4] Chen H,Charlat O,Tartaglia LA,et al.Evidence that the diabetes gene encodes the lep tin recep tor：Identification of a m utation in the lep tin recep tor gene indb/dbm ice[J].Cell, 1996,84：491-495.

[5] Ghilardi N,Ziegler S,W iestner A,et al.Detective STAT signaling by the lep tin recep tor in diabeticm ice[J].Proc Natl Acad SciU SA,1996,93：6231-6235.

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A Rap id SNP Genotype Assay for the leptinoband leptin rdbAlleles

O b jectiveTo establish a rap id SNP geno type assay fo r theleptinobandleptinrdballeles（single-tube bidirectional allele specific amp lification（SB-ASA）,and compared it w ith the traditionalm ethod of PCR-restriction endonuc lease digestion.M ethodsSeven and nine offsp ringsof ob/+and db/m heterozygousm ice,respectively,were genotyped by both the SB-ASA and PCR-restriction endonuc lease digestion.Resu ltsA ll the offsp ringswere successfully genotyped by both the two m ethods,and the resultswere identical.Conclusion sA rap id SNP genotype assay fo r theleptinobandleptinrdballeles has been successfully estab lished.Itm ay effectively p romo te the b reed ingwo rk of bo th the ob and dbm ice.

ob；db；SNP；single-tube bi-directional allele specific amp lification；mouse

An Overview on the M anagem ent of Laboratory M ouse Colonies

Sonja T.Chou （Charles River Preclinical Services，Shanghai201203，China）

R-33

A

1671-7856（2010）02-0054-04

胡培麗（1981-）,女,碩士研究生,研究方向：免疫遺傳檢測。E-m ail：hupeili-1981@163.com,電話：010-67639117。

岳秉飛（1960-）,男,研究員,博士。研究方向：動物遺傳學。E-m ail：yue-bingfei@nicpbp.org.cn,電話：010-67095401。

HU Pei-li,WANG Jin-heng,YUEB ing-fei

（National Institute for the Contro lof Pharm aceu tical and B io logical Products,Beijing 100050,China）

2009-11-10

專家論壇

【Abstract】Two lectures covering the management of laboratory mouse colonies were presented in November at the laboratory animalmedicine technical training seminars sponsored by the Chinese Association for Laboratory Animal Sciences in Xi’an.Topics covered include troubleshooting mouse reproductive performance and managing genetically engineered colonies.The purpose of this article is to highlight the materials covered and to offer references for further reading.It is advised that references cited in this article be reviewed for a more comprehensive coverage on the topics presented.Please also note that the princip les for breeding practice and genetic management of outbred m ice were not covered，but the author may be contacted for a list of suggested reading materials.

【Key words】M ice；Breeding colony；Management；Production

［Chinese Library Classification］R332 ［Docum en t code］A ［A rticle ID］1671-7856（2011）01-0005-07

10.3969/j.issn.1671-7856.2011.01.002