知母中α-葡萄糖苷酶抑制劑的提取分離及鑒定

藍 萍， 葉小利， 李學剛， 王 亮， 黃文文， 柳 明

(1.深圳市南山區赤灣學校，廣東深圳518068;2.西南大學藥學院藥用資源研究所，重慶400716;3.西南大學生命科學學院，重慶400715;4.國家海洋局第三海洋研究所，廈門361005)

知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根莖，是我國傳統的常用中藥，有清熱瀉火，生津潤燥等功效［1］。知母具有悠久的降血糖應用歷史，早在《神農本草經》就已有知母用于治療消渴癥的記載，市場上許多降糖中成藥如降糖舒膠囊、降糖膠囊、人知降糖膠囊等其主要降糖成分均為知母，現代也有研究表明知母多糖［2－3］、知母多酚［4］、知母皂苷［5］等都具有降血糖的作用。本研究以α－葡萄糖苷酶為作用靶標，以降糖舒膠囊及其主要成分知母為研究對象，對兩者的降糖效果進行了比較，并且對知母中抑制α－葡萄糖苷酶活性單體進行了提取、分離、純化以及結構鑒定，并研究了各組分對糖尿病小鼠的降血糖作用。

1 材料

1.1 藥材

試驗材料知母購自重慶眾景中藥飲片有限責任公司，由西南大學藥學院李學剛研究員研究鑒定。

1.2 試劑

4－硝基酚－α－D－吡喃葡萄糖苷(pNPG)，sigma 公司;谷胱甘肽sigma公司;四氧嘧啶標準品5 g包裝，sigma公司;阿卡波糖片(拜糖平)GMP產品，拜耳醫藥保健有限公司北京分公司;降糖舒膠囊(批號:080504)，吉林省輝南天泰藥業股份有限公司;5秒血糖儀及血糖試紙，北京怡成生物電子技術有限公司;芒果苷對照品購于sigma公司，蒸餾水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

RE－52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);LC－6AD液相色譜系統(日本島津公司)，D101大孔樹脂(天津南開大學化工廠)。Hitachi U－1800型紫外分光光度計(日本Hitachi儀器公司);CS1013電熱鼓風干燥箱(中國重慶實驗設備廠);X－4顯微熔點測定儀(溫度未校正)(上海福瑪實驗設備有限公司)。

1.4 動物

清潔級昆明種小鼠，體重18～22 g，由重慶第三軍醫大學動物室提供。

2 方法

2.1 降糖舒膠囊及知母各組分對體外α－葡萄糖苷酶抑制活力的測定

在 Matsui［12］法基礎上進行改進:取 pH 6.8磷酸鹽緩沖液 2 010 μL，待測樣品溶液 250 μL，3 mmol/L的谷胱甘肽80 μL和實驗室提取的α－葡萄糖苷酶各80 μL于4 mL的離心管中，在37℃恒溫水浴中反應10 min后，將反應液倒入比色皿中，加入 80 μL 硝基苯基－α－D－吡喃葡萄糖苷(pNPG)，于400 nm處測定在酶的作用下釋放出對硝基苯酚pNP的量，不加待測品溶液作為空白對照，每2 min讀一次吸光度值并記錄。每個樣品同時做3個平行，取平均值，然后做吸光度隨時間變化的關系曲線，可以發現吸光度與時間成正比例關系。取斜率K值，計算個組分抑制率。

2.2 降糖舒膠囊與知母測定樣品的制備

取10粒降糖舒膠囊，用1%吐溫80溶解，配置成0.001 g/mL的溶液待測。稱取干燥并粉碎好的知母粉末2.0 g，按照2.3.1項的方法制備得到知母浸膏0.65 g，1%吐溫80溶解，配置成濃度0.005 g/mL的溶液，用2.1項的方法測定并比較降糖舒膠囊與知母浸膏的降糖效果。

2.3 知母中α－葡萄糖苷酶抑制劑的提取分離及結構鑒定

2.3.1 知母中α－葡萄糖苷酶抑制劑的提取及分離

稱取知母500 g于CS1013電熱鼓風干燥箱58℃烘干，粉碎至全部通過100目篩孔，用2 500 mL(1∶5W/V)工業乙醇超聲波提取3次，每次提取時間為30 min，合并浸提液減壓濃縮，得到知母醇提物205 g。取知母醇提物50 g，用適量水充分溶解，水溶液經400 mL D101大孔樹脂充分吸附，依次用水、30%甲醇、60%甲醇、純甲醇洗脫，每個溶液濃度各收集800 mL洗脫液，減壓濃縮，得到4個組分:水洗脫組分Ⅰ(24.08 g)，30%甲醇洗脫組分Ⅱ(3.73 g)，60%甲醇洗脫組分Ⅲ(9.86 g)，純甲醇洗脫組分Ⅳ(10.58 g)。見圖1。

圖1 提取分離過程流程圖

將以上4個組分用1%的吐溫80充分溶解，配制成不同濃度的溶液，其中組分Ⅰ與組分Ⅳ所配濃度為0.01 g/mL，組分Ⅱ與組分Ⅲ濃度為0.001 5 g/mL，然后按照2.1項的方法測定其活力。有關結果見表1。

2.3.2 知母中α－葡萄糖苷酶抑制劑單體的提取和結構鑒定

對于抑制α－葡萄糖苷酶活性的組分(30%甲醇洗脫部位)，減壓濃縮除掉甲醇后，用適量水充分溶解(升溫、超聲)，然后在冰箱中放置，出現淡黃色結晶。過濾，分出結晶，再溶于甲醇中，冷卻結晶3次，得到淡黃色粉末0.52 g。薄層層析為一個斑點(給出2種展開劑)，對該粉末進行結構鑒定，有關如下:

淡黃色粉末;mp 267～272℃;氯仿－乙酸乙酯－甲酸(6 ∶2∶2)Rf=0.32，甲苯－正丁醇－甲酸(3 ∶4 ∶5)Rf=0.35;UV(CH3OH)λmax(nm):258;HPLC 檢測與芒果苷對照品出峰位置一致;1H NMR(DMSO－d6;300 MHz)δ (ppm):13.76(s，1H，1－OH)，10.58(s，2H，3－OH，6－OH)，9.72(s，1H，7－OH)，7.38(s，1H，8－H)，6.86(s，1H，5－H)，6.36(s，1H，4－H)，4.86(s，2H，3′－OH，4′－OH)，4.60(d，J=9.50 Hz，1H，1′－H，)，4.56(s，1H，6′－OH)，4.48(t，J=9.18 Hz，1H，2′－H)，3.69(d，1H，2′－OH)，3.67(d，J=2.55 Hz，1H，6′H)，3.34(dd，J=5.22 Hz，1H，6″H)，3.18(m，J3′H/4′H=9.18，J4′H/5′H=9.17 Hz，3H，3′，4′，5－H)。以上數據與文獻［6］報道一致，故鑒定為芒果苷。

2.4 芒果苷的測定方法［7］

色譜條件DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－0.1%甲酸(30:70);檢測波長:256 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫。精密稱取芒果苷對照品10 mg，加甲醇溶解，并稀釋至100 mL的量瓶中至刻度，搖勻，作為對照品溶液。以峰面積對不同濃度的標準品做標準曲線，結果線性方程:Y=39 164X－44 442，R2=0.999 7。試驗結果表明:芒果苷在10～80 μg/mL范圍內有良好的線性關系。

2.5 對糖尿病小鼠的降血糖作用

2.5.1 對四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影響［7］

取健康小鼠100只小鼠，♀♂各半，平衡飼養3 d。采用尾部靜脈注射四氧嘧啶70 mg/kg，即每只小鼠注射0.15 mL新配置好的9 mg/mL四氧嘧啶溶液。3 d后，測定空腹血糖，取血糖值大于10.0的作為造模成功小鼠，總計80只。將80只小鼠隨機分成4組，每組20只，分別為高糖模型組組，阿卡波糖組，降糖舒膠囊組，知母浸膏組，芒果苷組，按表3中劑量給藥，1次/d，分別給藥后第3天、6天，第9天采用尾靜脈取血，血糖儀測定餐后空腹血糖值。

3 結果

3.1 對α－葡萄糖苷酶的抑制作用

按照2.1項所描述的方法，測得吸光度隨時間的變化值，并繪制吸光度A對時間t的曲線，利用2.1項中的公式計算各組分對α－葡萄糖苷酶的抑制活力。見表1。

表1 各組分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

結果顯示，知母中各提取組分中30%甲醇洗脫組分對α－葡萄糖苷酶的抑制活性最強。而從30%甲醇洗脫組分中分離純化出的芒果苷對α－葡萄糖苷酶有更強的抑制活性，其抑制效果比降糖舒膠囊還好，由此可見知母為降糖舒膠囊主要有效成分，而芒果苷為知母中的α－葡萄糖苷酶抑制劑。

3.2 浸膏及各分離組分中芒果苷的含量 見表2。

表2 各分離組分中芒果苷的含量

3.3 知母浸膏及芒果苷的降血糖作用 見表3。

表3 知母生藥及芒果苷對糖尿病小鼠的降糖作用

從表3的統計結果顯示，知母浸膏與芒果苷均具有較好的降血糖功效，知母浸膏組的降血糖效果略優于芒果苷組，但是差異不顯著。

4 討論

傳統測定α－葡萄糖苷酶抑制效果的方法如Matsui［8］法和 Pieere［9］法等都是在加入酶、抑制劑，于37℃水浴孵育10 min后，加入pNPG啟動反應，然后在37℃水浴中反應30 min，加入0.1 mol/L Na2CO31 mL終止反應。于400 nm下測得在處測定在酶作用下從 pNP－G中釋放出的對硝基苯(pNP)的吸光度值。抑制率計算公式為:抑制率 =(A空白－A樣品組)/A空白。而本研究在酶、抑制劑 37 ℃水浴孵育10 min后，加入直接將反應在比色皿中進行，2 min測定一次吸光度A，以A隨時間t變化的斜率K值作為計算抑制率的依據。此種測定方法是以檢測時間內的平均值作為計算的依據，比傳統的方法更準確，同時也容易觀察各抑制劑的抑制效果隨時間變化的關系。

本實驗的研究對象知母是降糖舒膠囊的主要活性成分。目前國內外關于知母不同成分降血糖的報道很多，但是對知母進行系統提取分離，篩選降血糖活性成分的文獻報道并不多(僅有一篇)，而且該文獻報道的方法比較復雜，得用水提醇沉法得知母浸膏后，溶解調pH值，用不同溶劑萃取得到知母總酚過后過硅膠柱，然后用乙酸乙酯－MeOH進行梯度洗脫(500 ∶0→0 ∶250)，共收集 100 個流份［3］。本實驗所用提取方法操作簡單，不耗時，經濟，分離效果好，不管是實驗室操作還是工業化生產可行性強。試驗結果證明，知母和芒果苷作為一種α－葡萄糖苷酶抑制劑在治療糖尿病特別是Ⅱ糖尿病領域中具有較大的開發利用前景。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:148.

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［3］黃 芳，徐麗華，郭建明，等.知母提取物的降血糖作用［J］.中國生化藥物雜志，2005，26(6):332－335.

［4］楊軍衡，曾 雷，易 誠，等.中藥知母新皂甙成分的研究［J］.天然產物研究與開發，2001，13(5):18－21.

［5］N kashima N，Kimura I，Kimura M.Isolation of pseudoprototimosaponin AIII f rom rhizomes of Anemarrhena asphodeloides and its hypoglycemic activity in streptozotocin－induced diabetic mice［J］.Nat Prod，1993，56:345.

［6］Berenice G′omez－Zaleta ，Mar′ia Teresa Ram′rez－Silva，Atilano Guti′errez，et al.UV/vis，1H，and13C NMR spectroscopic studies to determine mangiferin pKa values［J］.Spectrochimica Acta Part A，64(2006):1002－1009.

［7］翟紅莉，孫連娜，來 威，等.HPLC法測定知母藥材及其相關制劑中芒果苷和新芒果苷的含量［J］.解放軍藥學學報，2007，23(6):472－474.

［8］Matsui T，Ueda T，Oki T.a－Glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins 1.survey of natural pigments with potent inhibitory activity［J］.J Agric Food Chem，2001，49(4):1948－1951.

［9］Pierre C，Roland R，Tremblay D，et al.P－Nitrophenol－α－glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activityin human semen［J］.J Clin Chem，1978，24(2):208－211.