大米草總黃酮微波提取工藝及其抗氧化活性研究

李盈蕾， 陳建華， 宋曉凱， 孫吉佑， 詹永成， 吳同巖

(1.淮海工學院化學工程學院，江蘇 連云港222005;2.江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港222005)

大米草(Spartina anglica)是美國互花米草與歐洲米草的雜交種，我國于1963年成功引進，具有耐鹽堿、耐淹、根系發達等特點，它可以起到保灘護岸、促淤造陸的重要作用，曾被稱為“先鋒植物”。不過，大米草的迅速蔓延，造成了生態失衡、航道阻塞，讓人類無法控制，它所引發的生態危害已經成了一個世界性的難題［1－2］。利用大米草的豐富資源，變害為寶，是對其生態防控的有效辦法。已有文獻報道，其同屬植物互花米草總黃酮類化合物具有降血脂等心血管方面的作用［3］，黃酮類化合物同樣是大米草的活性成分之一［4］，本實驗主要研究大米草總黃酮的提取工藝條件及其體外抗氧化活性。

1 儀器與材料

XH－100B 電腦微波催化合成∕萃取儀(北京祥鵠科技發展有限公司);UV－160A紫外－可見分光光度儀(日本島津);SHZ－D(Ⅲ)循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司);HWSY電熱恒溫水浴鍋(浙江舟山市定海區還遠儀器廠);JB/T 5374－1991電子天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司)。RE52CS旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);真空冷凍干燥機Genesis 2000 QS(美國VIRTIS)。

大米草(2008年5月采于連云港燕尾鎮沿海灘涂);蘆丁標準品(批號:10080－200306，中國藥品生物研究所);DPPH(批號:20090112，美國SIGMA公司);其它試劑均為分析純。

2 提取與純化

2.1 大米草總黃酮的測定［5］

2.1.1 標準曲線的測定 精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg，用無水乙醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得0.2 mg/mL 蘆丁標準液。分別精密吸取 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL蘆丁標準液于10 mL比色管中，加無水乙醇至5 mL，加入 5%NaNO20.3 mL，搖勻放置 6 min，再加入 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻放置 6 min，最后加 1 mol/L NaOH 4 mL，用無水乙醇溶液補至刻度，搖勻放置10 min后，以無水乙醇為空白對比，在510 nm處測定其吸光值，吸光值(A)與為溶液濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程為A=10.993C+0.001 1，R=0.999 3。結果表明，蘆丁在8～40 μg/mL與吸光度線性關系良好。

2.1.2 大米草總黃酮的提取工藝流程 稱取大米草干品5 g→粉碎→過20目篩→乙醇溶液浸泡8 h→微波萃取→抽濾→真空濃縮→乙醇定容于100 mL量瓶→大米草提取液待測液。

2.1.3 樣品總黃酮含量及提取率的測定 精密吸取大米草待測液1 mL，按照2.1.1項下方法操作，測定吸光度，按照回歸方程計算提取液中的總黃酮含量。按提取率=藥材中總黃酮質量/藥材質量×100%，計算總黃酮提取率。

2.2 微波提取條件的優化

微波法萃取植物總黃酮影響因素主要為:微波輻射量、所用的溶劑以及溶劑分數、用量、浸泡時間，萃取溫度及萃取時間等［6］。本研究中固定浸泡時間為8 h，因此主要討論微波輻射量、乙醇的體積分數、萃取時間和溶劑用量對提取率的影響。

2.2.1 乙醇體積分數的單因素考察 精密稱取4份5 g大米草樣品，分別加入體積分數為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，固定其它因素，按2.1.2項下操作，結果見圖1。可見，提取率隨著乙醇體積分數的增大而增高，50% ～70%之間提取率升高幅度較大，故可在此區間考查乙醇體積分數的影響。

圖1 乙醇體積分數對提取率的影響

2.2.2 微波萃取時間的單因素考察 精密稱取5份5 g大米草樣品，微波萃取，時間分別為 1、3、6、10、15 min，固定其它因素，按2.1.2項下操作，結果見圖2。可見，微波萃取時間在6～10 min之間提取率變化較大，在10 min達到最大值，然后提取率再次下降，可能是因為時間過長，黃酮易于分解，且時間過長，溫度過高，使細胞內蛋白凝固，黃酮不易溶出［7］。因此本試驗對于提取時間主要考察3～10 min內的影響。

圖2 萃取時間對提取率的影響

2.2.3 固液比的單因素考察 精密稱取4份5 g大米草樣品，分別按固液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 加入提取溶劑，浸泡8 h，固定其它因素，微波萃取，按2.1.2項操作，結果見圖3。可見，固液比在1∶40后變化不大，考慮到提取效果和減少溶劑用量等方面，將固液比定在1∶20～1∶40之間較合適。

圖3 物料比對提取率的影響

2.2.4 萃取溫度的單因素考察 鑒于2.2.2項下試驗結果，本試驗的萃取時間選在10 min內，此時間內微波萃取儀達不到要考察的溫度。故萃取溫度不作為考察因素。

2.3 微波提取工藝的優化－正交試驗

在微波提取的單因素試驗基礎上，選擇影響大米草總黃酮提取的主要因素提取時間(A)、微波功率(B)、溶劑濃度(C)、固液比(D)，每個因素取3個水平，見表1，以提取率作為評價指標對微波提取工藝進行優化，結果見表2。對結果進行統計學處理，方差分析結果見表3。

表1 因素水平

表2 L9(34)正交試驗設計

表3 方差分析

由表2及表3可知，影響大米草中總黃酮提取因素的主次順序為:D＞B＞C＞A;即固液比＞反應功率＞溶劑濃度＞反應時間。通過結果分析，正交實驗的最佳工藝為A2B1C3D3。即使用濃度為70%的乙醇，固液比為1∶40，在功率為400 W的條件下提取6 min效果最佳。

2.4 最佳提取工藝的驗證

取3份5 g大米草研碎，加入200 mL體積分數為70%乙醇溶液，浸泡8 h后，微波萃取功率為400 W，萃取6 min。結果見表4。最佳提取工藝的平均提取率為0.462%。比各組試驗提取率均高。

表4 最佳工藝重復實驗

2.5 大米草總黃酮的純化

取大米草總黃酮提取液，利用AB－8大孔樹脂純化，大孔樹脂的預處理及洗脫條件按文獻［8］操作，采用乙醇梯度洗脫，將20% ～40%乙醇洗脫液610 mL合并，濃縮、于培養皿中在低溫冰箱中冷凍，凝固后于真空冷凍干燥機中干燥，以用于進一步定性檢測及活性測定。冷凍干燥后得粉末狀粗大米草總黃酮。

3 抗氧化活性研究

3.1 大米草粗總黃酮定性驗證

取大米草粗總黃酮粉末0.5 g，蒸餾水定容于25 mL量瓶中，吸取2 mL，分別滴加Al(NO3)3溶液和鎂粉與濃鹽酸數滴，結果見表5。

表5 大米草總黃酮定性反應

從表5的結論可以看出，該反應屬于黃酮類化合物的特征顏色反應，說明此溶液中主要成分為黃酮類化合物。

3.2 體外抗氧化活性研究

3.2.1 大米草粗總黃酮對DPPH·自由基的清除作用 采用郭雪峰［9］的方法測定，取各濃度的大米草粗總黃酮溶液1 mL與257.7 mg/L DPPH 95%乙醇溶液(樣品對照為大米草粗總黃酮溶液1 mL與95%乙醇，DPPH對照為4 mL DPPH溶液與1 mL 95%乙醇溶液)于10 mL比色管中，振蕩，混勻，反應40 min后，用95%乙醇作參比對照，利用紫外分光光度計在518.4 nm處測定吸光度，測定結果分別記為As、Ar、Ao。陽性對照藥Vc同法操作。結果見表6。清除率Y%=［1－(As－Ar)/Ao］×100%。

表6 清除DPPH·

取大米草粗總黃酮溶液濃度與抑制率Y做線性回歸，得Y=852.65X+4.6096，r=0.9847。根據線性方程得出大米草粗總黃酮清除DPPH·自由基的IC50為0.053 2 mg/mL。大米草粗總黃酮與陽性藥Vc的抑制率相同時，根據回歸方程計算大米草粗總黃酮當量濃度為0.051 7 mg/mL，同等清除能力所需用量約為陽性藥Vc的5.17倍。

3.2.2 大米草粗總黃酮對羥自由基的清除能力 利用Fenton體系產生·OH［10］，向 Fenton 試劑中加入 Tris－HCl緩沖溶液、鄰二氮菲試劑、不同濃度的大米草粗總黃酮溶液(空白只加Tris－HCl緩沖溶液，樣品對照加Tris－HCl緩沖溶液和不同濃度的大米草粗總黃酮溶液，反應對照不加大米草粗總黃酮溶液，以及不加入H2O2不形成Fenton體系的陰性反應對照)于10 mL比色管中，振蕩，混勻。置入恒溫水浴鍋中，37℃下水浴1 h。利用空白對照，紫外分光光度計在510 nm處測定吸光度，分別記為 A樣、A提、A損、A未損。陽性對照藥 Vc同法操作，結果見表7。清除率Y%=［(A樣－A提)－A損/A未損－A損］×100%。

表7 清除·OH

取大米草粗總黃酮溶液濃度對抑制率Y做線性回歸，得Y=209.56X－48.71，r=0.986 8。根據線性方程，得出大米草粗總黃酮清除·OH的IC50為0.471 0 mg/mL。大米草粗總黃酮與陽性藥Vc的抑制率相同時，根據回歸方程計算大米草粗總黃酮當量濃度為0.352 5 mg/mL，同等清除能力用量約為陽性藥Vc的3.5倍。

4 討論

4.1 試驗結果表明，微波法提取大米草總黃酮最佳工藝為:70%的乙醇，固液比為1∶40，在功率為400 W的條件下提取6 min。方法簡便，快捷，節能。可做進一步中試試驗及擴大化操作。

4.2 ·OH是機體內氧化性最強的自由基，可促使機體肝、腦、腎組織以及腦線粒體脂質發生過氧化反應，進而引起細胞損傷［11］。大米草粗總黃酮清除·OH的能力較清除DPPH·的能力更強。可作為天然抗氧化劑做進一步研究。

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