組織工程化皮膚低溫保存的研究進展

陳凡凡 崔磊 曹誼林

組織工程化皮膚，是指有機體分離出來的表皮細胞或成纖維細胞在一種三維生長支架上進行體外復合培養，形成再生的表皮或真皮等同物。組織工程化皮膚作為一種皮膚創傷修復材料和損傷皮膚的替代品，不僅被覆在創傷表面、保護創面、促進皮膚的恢復和生長，而且支架材料中的活性細胞還能通過分泌生長因子促進細胞增殖、誘導細胞分化，使組織工程化皮膚最終能永久地代替損傷和（或）缺失的皮膚。為了縮短臨床上各種急慢性皮膚缺損患者等待體外構建組織工程化皮膚所需的時間，及時提供可供移植的替代“皮膚”，必須解決組織工程化皮膚的保存問題，這也直接關系到其商業化應用的前景。目前，國內外均在進行組織工程化皮膚的低溫保存和臨床應用研究，其關鍵是保存其中的細胞活性與功能、細胞與支架材料特異性粘附及支架材料的生物力學性能。賀旭等[1]對復方殼多糖組織工程化皮膚4℃保存的實驗發現,組織工程皮膚凍存7 d后，表皮活力值為未凍存時的62.46%，真皮活力值為未凍存時的54.21%。據報道，用含10%二甲亞砜、10%胎牛血清的抗凍劑-75℃保存,可保存6個月[2]。如果在-196℃的環境下，細胞、生物組織處于所謂“生命懸持狀態”，新陳代謝幾乎停止，在理論上幾乎可以無限期儲存[3]。因此，低溫冷凍保存是活體組織長期保存的一種有效方法，有望長期有效地保存組織工程化皮膚產品，建立組織工程化皮膚庫，以隨時提供臨床移植用的產品。

1 低溫凍存的概述

1.1 冰凍損傷兩因素假說

凍傷是低溫保護最大的負反應，組織與細胞凍傷的防治是低溫冷凍保存成功的關鍵。1972年，Mazur[4]提出冷凍損傷的兩因素假說，認為造成冷凍損傷有兩個獨立的因素：一是胞內冰的形成（Intracellular ice damage），是過快冷卻導致的，冷卻速度越快損傷越大；另一是“溶質損傷”（Solute damage），或稱“溶液損傷”（Solution damage），是因冷卻過慢而產生的，是由于細胞在高濃度的溶液中暴露時間過長，冷卻速度越慢損傷越大。快冷卻是傳熱起主要作用的過程，水分來不及滲出胞外，大量胞內冰形成。慢冷卻是質量遷移起主要作用的過程，水分由胞內大量滲出，細胞劇烈收縮，但無胞內冰產生。由于此兩因素的綜合作用，理論上就必然存在某一最佳冷卻速率，并對應于低溫保存的最佳存活率。

1.2 冷凍保護劑（Cryoprotective agent，CPA）

在不加冷凍保護劑而直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH值改變、蛋白變性等，引起細胞死亡。所以，細胞和生物體的低溫保存離不開冷凍保護劑。冷凍保護劑又稱抗凍劑，合理地選擇冷凍保護劑對低溫保存至關重要。冷凍保護劑應具有以下特點：易溶于水，對細胞無毒，易從組織細胞中清除。其作用主要表現在增加膜通透性，加速細胞內的水分流到細胞外結冰，穩定細胞膜結構，降低冰點，提高溶液的粘滯性，阻止冰晶生長。

冷凍保護劑大致分為兩類。一為滲透性冷凍保護劑，多屬低分子中性物質，在溶液中易結合水分子，發生水合作用，使溶液的黏性增加，從而弱化水的結晶過程，達到保護目的。常用的滲透型冷凍保護劑有甘油、二甲亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但滲透型冷凍保護劑使用濃度、滲入細胞的能力、對水分子活性的影響等各不相同，如甘油適宜于慢速冷卻，而DMSO卻易于滲入細胞，并在常溫下稍有毒性。二是非滲透型冷凍保護劑，能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態，可在特定溫度下降低溶質（電解質）濃度，從而起到保護作用。非滲透型冷凍保護劑主要有聚乙烯吡咯烷酮（Polyvingyl pyrollidone，PVP）、蔗糖（Sucrose）、葡聚糖（右旋糖酐，Dextrane）、聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）、白蛋白（Albumin）、羥乙基淀粉（Hydroxethyl starch， HES）等。此類冷凍保護劑對快速、慢速冷卻均有保護效果。

冷凍保護劑雖有保護作用，但也有一定的毒性。其毒性作用機制可能是：①通過細胞膜引起的滲透性損傷（物理性損傷）；②與蛋白質和（或）脂膜結合，使之變性（化學性損傷）。這些損傷與溫度、防凍劑的含量有關。一般是溫度越低時，冷凍保護劑毒性越小；冷凍保護劑含量越高，毒性越大。因此，保護劑的種類、濃度及加入、清除的方式對細胞的存活都有一定的影響。

2 組織工程皮膚的低溫保存

組織工程產品深低溫保存中使用冷凍保護劑的目的是通過替換細胞和組織內的水分，將降溫-凍存-復溫循環中冰晶形成引起的損害減到最小，并促進細胞非結晶態的生成。組織工程化皮膚根據解剖和發揮的主要替代作用可以分為表皮替代物、真皮替代物和復合皮膚替代物。目前的低溫保存研究的熱點，主要集中在真皮替代物和復合皮膚替代物的保存。

2.1 真皮替代物的低溫保存

Teasdale等[5]研究了低溫保護劑種類以及降溫速率對以膠原凝膠為支架的組織工程化真皮活性的影響，結果表明，以DMSO為低溫保護劑，以較低的速率降溫可取得較好的保存效果。Applegate等[6]就組織工程化真皮低溫保存過程中存在的問題進行了綜述，指出細胞損傷是影響真皮替代物低溫保存效果的主要因素之一，且體外培養的細胞更易于形成胞內冰，而支架材料、細胞及細胞外基質熱膨脹系數的差異可能會形成導致組織及細胞損傷的熱彈性應力。王欣等[7－8]對以聚羥基乙酸（PGA）纖維（編織）為支架的組織工程化真皮，用DMSO為低溫保護劑進行了程序降溫的低溫保存實驗，探討低溫保護劑的濃度、降溫速率等對組織工程化真皮低溫保存效果的影響。實驗顯示，培養14 d的組織工程化真皮置于10%DMSO溶液中，以1℃／min速率降溫至-196℃可獲得75%的細胞存活率，可滿足臨床應用的要求。

2.2 復層組織工程化皮膚的低溫保存

Harriger等[9]采用培養的人角質細胞和成纖維細胞制成的組織工程皮膚，以10%DMSO為防凍劑，進行20℃/min的程序性降溫，至-196℃保存，然后置于37℃水浴中快速復溫，發現組織工程化皮膚活力欠佳，認為可能與防凍劑的含量有關。Kentaro等[10]將成纖維細胞擴增后種植于皮膚支架上，支架由單層的海綿狀透明質酸和膠原構成，凍存保護劑為DMEM+10%DMSO+40%胎牛血清。結果顯示，在-152℃保存3周,復蘇后最高的即刻細胞存活率為56.2%，經過37℃水浴快速復蘇并再培養1周后，細胞數量擴增到凍存前的200%。后續研究顯示，在-152℃保存1年后，細胞存活率為52%；保存2年將降至29.5%；經-80℃保存6個月，或-152℃保存1年，都能保持足夠的細胞活力和增殖活性，并表達足夠的成纖維細胞生長因子[11]。魯元剛等[12]研究了復方殼多糖人工皮膚的凍存，他們將培養1周的人工皮膚置于含90%基礎培養基 ＋10%DMSO的凍存液中，按4℃30min、0℃過夜、-20 ℃ 2～3 h、液氮氣相 6～8 h、液氮液相的凍存，復蘇后培養1 h，可見真皮基質內的成纖維細胞又伸出突起，開始生長，但在細胞外基質中發現有較大的孔隙，且大小不均勻；繼續培養1周后，胞外基質孔隙基本消失，表皮可大致區分為基底層、棘層和角質層，各層均有層數不等的扁平梭形細胞，外周的表皮細胞結合不甚牢固，易脫離。人工皮膚的真皮部分，可見呈梭形結構的成纖維細胞大致平行排列，分布有序。所有復蘇的標本都恢復了正常的代謝活動，角質形成細胞與成纖維細胞的生長特性與未進行凍存的人工皮膚基本相同。

2.3 玻璃化低溫保存方法

從目前的研究成果看，傳統的低溫保存技術對僅含成纖維細胞的真皮替代物保存效果較佳，能滿足臨床應用的要求，而對雙層組織工程化皮膚的保存效果并不理想，因其對表皮細胞的損害較大。因此，玻璃化保存可能是組織工程化皮膚產品更理想的保存方法。玻璃化（Vitrification）是指液體轉變為非晶態（玻璃態）的固化過程。溶液在冷凍過程中黏稠度增高，相變后轉變成固態時，不形成或只形成對細胞結構無損傷的極小冰晶，高黏性使分子的彌散受到極度抑制，液體固化為玻璃態，從而避免冰晶形成過程中對細胞的損傷。使溶液玻璃化有兩條途徑：一是大幅度提高冷卻速率；二是增加溶液濃度。玻璃化低溫保存方法，是將生物組織或細胞經極高濃度的玻璃化溶液快速脫水后，直接投入液氮，使生物材料連同玻璃化溶液發生玻璃化轉變，進入玻璃態。保存終止后，復溫要快速化凍，防止去玻璃化的發生。生物組織或細胞能安全渡過冷卻和化凍兩個關口，就可保證凍存的成功。但是，高濃度的冷凍保護劑對生物組織或細胞具有潛在的毒性反應，而且這種毒性反應與冷凍保護劑濃度和溫度密切相關。因此，用玻璃化法凍存組織細胞[13－15]的關鍵是在可形成玻璃化狀態的前提下，盡可能選擇較低的冷凍保護劑濃度，以減小冷凍保護劑的毒性反應，并仔細控制好整個玻璃化保存過程的操作環節，達到保存組織細胞結構和功能的目的。玻璃化保存液已可成功保存如胰腺[16]、組織工程化骨[17]、干細胞[18]、皮膚和表皮細胞[19－22]、血管[23]、氣管[24]等。 Pasch 等[19]把角質細胞種植于小培養皿形成細胞單層，比較了100 g/L丙三醇、100 g/L乙二醇、100 g/L DMSO和10%的羥乙基淀粉（HES）對單層角質細胞的保存效果。結果發現，復溫后細胞層在光鏡下完整無裂隙，HES以3℃/min速率降溫得到了28.5%的細胞回收率，明顯優于1℃/min的降溫速率，也優于DMSO等其他3種保存劑。其后續研究提示，單層細胞凍存的回收率要高于懸浮細胞凍存組[20]。程啟康等[21]用包含5.4 mol/L乙二醇和1.4 mol/L DMSO的玻璃化液凍存成纖維細胞獲得了87.1%的細胞存活率。組織工程化皮膚產品的玻璃化溶液配方、達到玻璃化的深低溫過程、損傷機制、復溫條件等研究尚處于起步階段，還需深入研究，其有效性亟待驗證。

2.4 海藻糖在玻璃化凍存中應用

玻璃化法縮短了冷凍處理的時間，簡化了步驟，不需要昂貴的設備，不要求嚴格的降溫速率，但最不利的因素就是高含量的防凍劑的毒性作用。所以，降低玻璃化保存液中透入性抗凍劑的含量，或完全由糖類、聚合物替代，以降低其毒性和解凍時對細胞的滲透性破壞是目前的主要研究方向。在非滲透性保護劑中，海藻糖是目前研究的熱點。它是由2個葡萄糖分子以α,α,1,1,-糖苷鍵構成的非還原性糖，自身性質非常穩定，能夠在高溫、高寒、干燥失水等惡劣的條件下，在細胞表面形成特殊的保護膜，有效保護生物分子結構不被破壞。它的抗凍機制[25－29]是多方面的：①在冷凍之前使細胞脫水，減少細胞內的含水量，并在生物分子表面依靠帶電荷的水合基團間的氫鍵形成保護膜，代替了維護三級結構所必需的水分子，從而使組織在極低水分時仍保持細胞膜結構功能的完整性，避免細胞內成分的損失；②有助于避免滲透性保護劑滲入細胞所導致的過度膨脹和滲透性休克；③能代替脂質分子頭部基團間的水分子，降低膜的相變溫度，防止重新水化時脂質狀態的轉換及伴隨出現的裂縫；④能非特異性地穩定細胞內生物膜、蛋白質和核酸等生物大分子結構；⑤具有極佳的玻璃化特性，其玻璃化溫度接近-30℃，比傳統滲透性保護劑的玻璃化溫度（<-65℃）要高得多。海藻糖已被應用于胚胎干細胞[30]、精子[31]、紅細胞[32]、皮膚[33]等。 Erdag 等[33-34]發現，應用海藻糖/DMSO作為保護劑，能提高凍存的胎兒皮膚的活力。將該方法所凍存的皮膚移植到免疫缺陷大鼠后，移植面與新鮮未冷凍皮膚移植組無明顯差別，并且顯著的優于傳統保護劑組。

3 展望

目前，組織工程化皮膚僅限于個性化、小規模的應用，停留在臨床研究和實驗室水平。要真正形成產業，必須解決組織工程化皮膚的保存問題，建立標準化的保存方法。因此，凍存技術將在組織工程化皮膚的研究與開發應用中發揮重要作用，相信隨著組織工程化皮膚玻璃化凍存研究的不斷深入，組織工程化皮膚的產業化、商品化將獲得實現，成為臨床治療皮膚損傷和缺損的首選方法。

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