人胚胎干細胞定向分化為血管內皮細胞的初步研究

王彥 錢德儉 尉真 陸峻泓 張文杰 崔磊 曹誼林

血管再生在骨創(chuàng)傷后組織修復中占有舉足輕重的地位。人的血管發(fā)生是一個非常復雜的細胞生物學過程，包括：血管形成（Vasculogenesis），由未分化的胚胎干細胞分化為成血管細胞（Angioblast），再形成內皮細胞，彼此連接組成血管；血管新生或芽殖（Angiogenesis），由已形成的微血管內皮細胞沖破管壁的基質，遷移、增殖和連接組成新的血管[1]。這兩種方式在胚胎發(fā)育過程中均有出現(xiàn)，且時間上往往交錯進行。而成體創(chuàng)傷后，組織修復中血管的發(fā)生主要是芽殖方式。近年來，組織工程技術的迅猛發(fā)展給骨創(chuàng)傷后組織修復的基礎研究和臨床治療提供了新的思路。

人胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ES）具有向三個胚層分化的潛能，是研究人胚胎發(fā)育和細胞分化的理想模型。隨著人ES細胞系的建立，應用人ES細胞研究內皮細胞發(fā)生和血管形成成為可能[2-7]。我們將來源于人囊胚內細胞團的ES細胞，以含維甲酸（Retinoic acid，RA）的培養(yǎng)液經懸浮培養(yǎng)，形成擬胚體（Embryonic body，EB），再將 EB 貼壁，換含TGF-β1的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成內皮細胞。該方法為研究骨創(chuàng)傷修復中內皮細胞和血管發(fā)生及其機制建立了一個良好的模型，且有望為臨床治療提供新的種子細胞。

1 材料和方法

1.1 材料

人ES細胞株 （上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院組織工程實驗室），knock-out DMEM（Gibco公司，美國），KO Serum Replacer（Hyclone 公司，美國），Non-essential Amino Acids（Gibco 公司，美國），L-glutamine（Sigma 公司，美國），β-mercaptoethanol（Sigma 公司，美國），b-FGF（Sigma 公司，美國），維甲酸 （Sigma公司， 美國），TGF-β1 （R&D 公司，美國），絲裂霉素 C（Sigma 公司，美國），Oct-4 抗體(兔抗小鼠多抗，中科院上海生化細胞所)，SSEA-4抗體（兔抗小鼠多抗，中科院上海生化細胞所），兔抗人Ⅷ因子抗體 （Santcruz公司，美國），鼠抗CD34單抗（Santcruz公司，美國），昆明小鼠（山東大學動物實驗室）。

1.2 方法

1.2.1 人 ES 細胞培養(yǎng)

培養(yǎng)液為knock-out DMEM，含20%knock-out serum replacer、1%non-essential amino acids、1 mM L-glutamine、0.1 mM β-mercaptoethanol、4 ng/mL bFGF。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；5～7 d后，以 1 mg/mL Ⅳ型膠原酶消化，常規(guī)傳代。

1.2.2 擬胚體培養(yǎng)及誘導

取生長良好的人ES細胞，機械法分割成小塊，接種到預先鋪陳1%瓊脂的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為knock-out DMEM，含 20%knock-out serum replacer、1%non-essential amino acids、1 mM L-glutamine、0.1 mM β-mercaptoethanol，加維甲酸，至終濃度為1×10-9mol/L ，37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 3～5 d，收集生長較好的擬胚體，均等地移植到預先用0.1%明膠鋪陳的培養(yǎng)皿中，每孔約3～4個擬胚體，加含3 ng/mL TGF-β1的無血清DMEM，每隔2天換液，繼續(xù)培養(yǎng)。對照組加不含TGF-β1的無血清DMEM。每天觀察照相，并做相關檢測。

1.2.3 免疫熒光檢測

抗體：兔抗人Ⅷ因子抗體，工作濃度1∶100；羊抗兔IgG-羅丹明，工作濃度1∶50。免疫熒光染色：待擬胚體周圍分化出上皮樣和圓形細胞及血管樣結構時，用PBS漂洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，再次PBS漂洗，0.25%Triton處理10 min，滴加Ⅷ因子抗體，37℃溫育1 h，PBS洗 3次，加 IgG-羅丹明，37 ℃反應 45 min，PBS 漂洗，甘油/PBS（1∶2）封固，熒光顯微鏡觀察，照相。

1.2.4 Dil-Ac-LDL 標記檢測

以無血清DMEM稀釋Dil-Ac-LDL為10 μg/mL，加至已分化出血管樣結構的擬胚體培養(yǎng)皿中，37℃孵育4 h，將其去除，無血清DMEM洗3遍，熒光顯微鏡觀察，照相。

1.2.5 掃描電鏡觀察

取誘導后分化出的上皮樣和圓形細胞及血管樣結構，以2%戊二醛固定，PBS漂洗，1%鋨酸固定，PBS漂洗，梯度乙醇脫水，醋酸正戊酯置換，CO2臨界點干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.6 透射電鏡觀察

取誘導后分化出的上皮樣和圓形細胞及血管樣結構，2%戊二醛固定24 h，收集標本，1%鋨酸后固定1 h，梯度乙醇脫水，1∶1丙酮包埋液滲透，EPON包埋，常規(guī)超薄切片，透射電鏡（JEM-1200EX）觀察細胞與血管的超微結構。

2 結果

2.1 人ES細胞細胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)的人ES細胞在飼養(yǎng)層細胞上以巢狀方式生長（圖1），細胞間界限清楚，細胞質結構簡單，細胞核質比例高。

圖1 人ES細胞克隆（P17）（相差顯微鏡，100×）

2.2 擬胚體培養(yǎng)及誘導

培養(yǎng)的第5天，培養(yǎng)皿中形成球形的擬胚體，透亮、邊緣光潔 （圖2）。將EB貼壁，用含3 ng/mL TGF-β1的無血清DMEM誘導，第2天，EB周圍出現(xiàn)上皮樣和圓形細胞（圖3）；第3天，開始出現(xiàn)由圓形細胞構成的管狀結構，且圓形細胞逐漸變?yōu)楸馄綘罴毎９軤罱Y構自EB向周圍呈輻射狀生長，并漸連接成網(wǎng)狀，管道排列清楚（圖4）。誘導組約有95%可分化為這類結構，而對照組絕大多數(shù)EB周圍未發(fā)現(xiàn)血管樣結構產生。

圖2 人ES細胞懸浮培養(yǎng)形成擬胚體（相差顯微鏡，100×）

圖3 擬胚體貼壁第2天，圓形細胞出現(xiàn)（相差顯微鏡，100×）

圖4 擬胚體貼壁第3天，上皮樣細胞及血管樣結構出現(xiàn)（相差顯微鏡，100×）

2.3 免疫熒光檢測

人ES細胞誘導分化的細胞，經Ⅷ因子免疫熒光檢測呈陽性（圖5），證明這類細胞具有內皮細胞性質。

圖5 人ES細胞誘導分化的管狀結構Ⅷ因子表達陽性（40×）

2.4 Dil-Ac-LDL 標記檢測

Dil-Ac-LDL攝取實驗結果呈陽性，表現(xiàn)為紅色熒光（圖6），證明hES細胞定向誘導分化的細胞具有內皮細胞的功能。

圖6 Dil-Ac-LDL攝取實驗陽性

2.5 掃描電鏡觀察

管狀結構的管壁最初由許多圓形細胞和扁平狀細胞組成，隨著管狀結構的延伸，細胞逐漸減少，管壁變得光滑（圖7）。

圖7 掃描電鏡觀察

2.6 透射電鏡觀察

誘導出的血管樣結構由幾個內皮樣細胞圍成，細胞扁平，表面較光滑，相鄰的細胞間連接緊密，與正常毛細血管結構非常相似（圖8）。

圖8 透射電鏡觀察

3 討論

血管形成是非常復雜的過程，主要涉及內皮細胞的激活和增殖、微環(huán)境中的細胞基質成分和結構，以及它們之間的相互作用[8]。同時，這些過程又和各種細胞因子的產生及協(xié)同作用是分不開的[9－10]。已有證據(jù)表明，TGF-β1是血管形成的刺激因子，在創(chuàng)傷愈合過程中，可能是通過調節(jié)細胞基質合成，從而影響內皮細胞的生長行為，使其形成管狀結構[11－12]。另有研究認為，內皮細胞的增殖刺激或抑制效應依賴于 TGF-β1的濃度，0.02～0.1 ng/mL 的 TGF-β1 對胎牛心臟內皮細胞顯示生長刺激作用，而高濃度（0.5～10 ng/mL）的 TGF-β1 則顯示生長抑制作用[13]，表明TGF-β1對內皮細胞生長和血管結構形成有著密切關系。

ES細胞不同的生長方式和所受RA濃度對其分化細胞類型有重大影響[14]。低濃度RA（1×10-9mol/L）和TGF-β1協(xié)同作用，易使ES細胞誘導形成中胚層性質的分化細胞[15]。本實驗用懸浮培養(yǎng)法結合低濃度RA處理5 d，使人ES細胞形成EB，然后移至明膠包被的培養(yǎng)皿中，以含TGF-β1的培養(yǎng)液使其貼壁生長，數(shù)天后EB周圍出現(xiàn)大量圓形細胞，同時形成許多自EB向周圍輻射的血管樣結構，該現(xiàn)象重復性高，表明低濃度RA和TGF-β1協(xié)同作用，對人ES分化并形成管樣結構有重要作用。

vWF是一種存在于血漿中的大分子糖蛋白，是凝血因子Ⅷ的載體，主要由內皮細胞合成，可使血小板黏附并聚集在受損的血管壁。vWF被認為是內皮細胞的特異性標記[16]。DiI是一種親脂性碳花青染料，容易嵌進生物質膜內，并在膜內做定向擴散運動，從而標記整個細胞。熒光染料DiI標記的低密度脂蛋白 （Low density lipoprotein，LDL）， 即 Dil-LDL被廣泛應用于內皮細胞的鑒定[2，17－18]。本實驗中，vWF免疫熒光染色和Dil-LDL直接熒光檢測結果均為陽性，表明構成管樣結構的細胞具有內皮細胞性質。證明低濃度RA和TGF-β1可誘導人ES細胞分化為內皮細胞及血管樣結構。

相差顯微鏡和掃描電鏡觀察證實，人ES細胞所分化的管狀結構的管壁，最初由許多圓形細胞或扁平狀細胞組成，隨著管狀結構的延伸，管壁變得光滑。該結果提示，本誘導體系作用于人ES細胞，可在體外模擬血管形成的演變過程。

透射電鏡結果顯示，誘導的血管樣結構由扁平細胞圍成，細胞表面較光滑，相鄰細胞間有緊密連接，與正常的人毛細血管非常相似。

本實驗提供了一個研究內皮細胞發(fā)生和血管形成的模型。但是，RA與TGF-β1的作用機制，以及ES細胞向血管演變中參與的因素等問題尚需進一步研究。另外，作為內皮細胞的來源之一，ES細胞分化為內皮細胞的研究還面臨很多問題，如分化細胞的純化，傳代與大量擴增以及保存等，這些問題的解決，將能使ES細胞成為較好的種子細胞來源。

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