血管瘤動物模型的研究進展

麥華明 鄭家偉

血管瘤動物模型的研究進展

麥華明 鄭家偉

血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，典型特點是其生命周期分為3個階段：增殖階段發生在1歲左右，以內皮細胞增殖為特點，沒有明確血管結構，管腔內紅細胞不明顯；消退期發生在1歲時，可持續到3～5歲，該階段增殖減慢或停止，血管結構變得明顯，管腔增大；消退完成期在5～8歲，這時血管被纖維脂肪殘余和毛細管大小的管腔所替代[1]。通常情況下，血管瘤的預后良好，但部分兒童的腫瘤會影響組織和器官功能，甚至可危及生命。血管瘤的研究，從最早的使用雞冠作為簡單動物模型[2]到最新的血管瘤干細胞移植，隨著現代分子生物學技術的快速發展，出現了使用各種技術建立的血管瘤動物模型。盡管目前還未能成功建立完全模擬血管瘤生物學行為特點的模型，但已有的進展為探索血管瘤的發病機制和臨床靶向治療奠定了基礎。本文就血管瘤動物模型的研究進展進行綜述。

1 多瘤病毒及基因轉錄

小鼠多瘤病毒（Murine polyomavirus，MPyV）是一種小DNA病毒，自1953年被發現以來，眾多學者對其在腫瘤發生、發展中的作用進行了深入研究，發現它在體外能使細胞惡性轉化，在小鼠的乳腺、唾液腺、骨、皮膚等器官組織能誘發多種腫瘤，如血管瘤、癌、肉瘤、淋巴瘤等。其基因的早期序列為重疊基因，編碼3種蛋白質，即大T抗原（LT）、中T抗原（MT）和小T抗原（ST），它們具有相同的氨基端。MT被認為是病毒的主要癌基因，其編碼的蛋白質是由421個氨基酸組成的膜結合蛋白，分子量為56 kD，通過疏水的羧基端將其錨著在細胞膜上，蛋白的大部分位于胞質內，并具有與磷酸激酶牢固偶聯的特性，其中在Tyr-250、Tyr-315和Tyr-322處存在3個酪氨酸位點，可被特異性酪氨酸激酶系統磷酸化。目前認為，Tyr315本身的磷酸化是MT抗原引起細胞轉化表型形成的關鍵過程，MT通過干預細胞信號轉導機制影響細胞分裂。Bautch等[3]證實，多瘤病毒中的MT抗原基因對內皮細胞特別易感，將其整合到小鼠正常基因序列中，是小鼠罹患血管瘤的根本原因。Sandra等[4]用高濃度的PyV通過腹腔注射入大鼠體內，9 d后出現了大腦、皮膚、腹膜的血管瘤，腫瘤生長快速，伴發腦出血和貧血，導致大鼠在注射病毒后的3周內死亡。徐骎等[5-6]應用DNA顯微注射法，將PyMT基因導入小鼠受精卵，并植入母鼠輸卵管，從而將PyMT基因整合到小鼠DNA正常序列中，得到了主要分布于皮膚和黏膜表面的全身多發性血管瘤的小鼠動物模型，但產仔率低，存活時間不長（圖1）。王延安等[7-8]通過PCR方法，從雞的基因組序列中克隆絕緣子元件，構建四環素誘導調控的條件化轉基因質粒，并將其調控元件和受控元件串聯成一個載體，將MT基因亞克隆至此載體，行小鼠受精卵原核注射，獲得轉染MT基因陽性小鼠。強力霉素體外誘導部分陽性鼠MT基因表達，建立了可以傳代的四環素誘導調控的MT轉基因小鼠模型，但所形成的血管瘤樣病變為囊性結構，組織學上更接近靜脈畸形。

圖1 應用DNA顯微注射法，將PyMT基因導入小鼠受精卵，從而將PyMT基因整合到小鼠DNA正常序列中，得到了全身多發性血管瘤的小鼠動物模型

Williams等[9]用將攜帶PyMT的鼠內皮瘤細胞移植到成年小鼠體內，能誘導產生血管瘤，發現瘤體內的絕大多數內皮細胞來源于宿主。Dubois-Stringfellow等[10]將表達完整多瘤病毒早期編碼區的基因轉入小鼠，然后形成多發性血管內皮瘤，再將瘤體內的血管內皮細胞系提取，培養后注射入小鼠皮下或腹腔，均產生了血管腫瘤，組織學上符合血管內皮瘤或血管瘤，瘤體內有出血，還伴有血小板減少、貧血和脾腫大等卡-梅綜合征癥狀。隨著腫瘤的快速生長，卡－梅綜合征加重，小鼠在3～5周內死亡，腹腔內注射的死亡時間更快，在注射1～2周后死亡。Bussolino等[11]將多瘤病毒中T抗原基因轉化到小鼠，從形成的內皮瘤中培養出能夠穩定致瘤的End內皮細胞系列；Vergani等[12]將其植入裸鼠，產生了血管瘤樣病變，由于其成瘤率高，效果明顯，該動物模型常被用作藥物作用的研究[13-15]。Sausville等[16]使用重組RCAS/PyMT病毒感染SCL-TVA小鼠，將PyMT轉化到小鼠體內的血管內皮祖細胞中，發現在小鼠腹膜后、肝、腸、卵巢、子宮等全身多發性血管瘤形成，但小鼠很快因內出血而死亡。據他們推測，可能是因為轉入PyMT基因后，血管內皮祖細胞向血管瘤干細胞轉化。

但不管使用何種轉基因方式，PyMT誘導所形成的腫瘤組織學特征偏惡性，更接近于血管肉瘤或血管內皮瘤。

2 血管瘤組織移植法

Tang等[17]將人快速增殖期血管瘤的組織切片分成96份，按6份/鼠移植到裸鼠皮下，發現移植存活率為84.4%，在植入后2～4個月移植組織生長，然后逐漸消退。組織學檢查發現，在植入后早期，細胞發生水腫、變性、壞死；大約30 d后，細胞密度升高，第45天時開始有絲分裂。在植入2個月后，移植組織主要由血管瘤組織組成并表現出消退的征象（圖2）。隨后，消退逐漸明顯，移植組織逐漸被纖維脂肪組織替代，其主要的組成細胞是宿主的內皮細胞。但是，之前的研究結果卻相反，血管瘤組織單獨移植到裸鼠1個月后，所有移植瘤組織都不同程度地變小；90 d時，部分腫瘤完全吸收，其余均不同程度地變小、硬化、消退。鏡下觀察移植瘤組織，單純腫瘤移植組均呈壞死、吸收，有大量吞噬細胞、纖維組織及少量小膿灶形成[18]。不同的結果可能與移植的血管瘤組織的不同增殖活性有關。他們還發現，在移植后每周肌注大劑量雌激素1次，1個月內的移植血管瘤組織體積無明顯改變，1～3個月后體積增大，組織學表現符合毛細血管瘤特征[18－19]。該模型的建立，明確了雌激素對血管瘤的促進作用，成功保持了血管瘤的生物學特征，但尚不能進一步地闡明血管瘤的發生機制。

圖2 將快速增殖期的人血管瘤組織切片移植到裸鼠皮下建立血管瘤動物模型

3 血管生長因子轉基因技術的應用

許多研究發現，在血管瘤組織中，內皮細胞生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等血管生長因子高表達；在動物實驗中，應用VEGF基因表達治療缺血性疾病如心肌梗塞時，血管生長因子的過量表達會在局部產生小的血管瘤樣病變[20]。

Gualandris等[21]以反轉錄病毒載體，將人bFGF的cDNA轉染入小鼠主動脈內皮細胞系，將細胞注射入裸鼠后，產生了類似卡波西肉瘤樣的血管化病灶；注射到無血管的兔角膜，可誘導血管生長；注射入雞囊胚，則在絨毛尿膜囊形成血管瘤樣病變。

Kitajima等[22]通過轉基因技術，在兔肝局部以高表達的VEGF來研究VEGF165與動脈硬化癥的關系，卻發現轉基因兔肝血竇增大，形成大小不同的血管網，具有彌漫性血管瘤的特征，同時發生溶血性貧血、血小板減少癥和脾腫大等卡－梅綜合征類似癥狀（圖3）。許振起等[23]向裸鼠皮下移植重組腺相關病毒包裝的人血管內皮細胞生長因子（hVEGF121）質粒，觀察到注射部位腫塊的隆起和變小等與血管瘤相似的變化，成瘤率為100%。組織學檢查發現，基因移植處的組織內大量新生內皮細胞排列成紊亂的管腔狀結構。

圖3 將顯微注射VEGF165cDNA進入兔受精卵，獲得在肝細胞特異性表達hVEGF的轉基因兔

4 血管瘤干細胞移植技術的應用

Boye等[24]發現，血管瘤內皮細胞是無性繁殖的，并表現出增高的生長和遷移特性。Walter等[25]分析增殖期血管瘤組織切片，發現了細胞的克隆性質。大量研究發現，血管瘤內皮細胞可能來源于同一個原始干細胞。2008年，Khan等[26]首次報道從嬰幼兒血管瘤組織中提取出血管瘤干細胞（HemSCs），這種干細胞具有旺盛的增殖活性，將單個細胞克隆后，植入裸鼠體內，7 d后可形成人類血管，從血管組織提取出干細胞，植入第2只裸鼠后，能再次形成血管組織。這種形成的血管組織能夠表達嬰幼兒血管瘤的免疫診斷標志物GLUT-1和Merosin；植入2個月后，血管數目減少，而脂肪細胞變得明顯（圖4），證實血管瘤來源細胞在裸鼠體內形成了血管和脂肪細胞。該研究重建了獨特的嬰幼兒血管瘤演變過程：形成血管，隨后轉變為脂肪組織，提示干細胞可能是嬰幼兒血管瘤的來源細胞。但所形成的血管瘤組織并沒有出現與臨床類似的快速增長，可能與遺漏了關鍵的細胞成分有關。血管瘤組織中是否存在干細胞，其作用機制和調控機制等，均有待深入研究。

圖4 采用血管瘤干細胞建立裸鼠模型

5 其他技術

Spitsbergen等[15]將致癌物N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍與斑馬魚胚胎或魚苗接觸，誘導了血管瘤、血管肉瘤等一系列間質細胞腫瘤的發生，但多數為惡性腫瘤。

Dyck等[28]通過aP2-Cre轉基因技術調控多形性腺瘤基因1（PLAG1）在小鼠的表達，發現在腺體、生殖腺、肩胛區等富有脂肪組織的部位PLAG1過表達，導致海綿狀血管瘤樣病變的產生。他們推測，這可能與PLAG1誘導了胰島素樣生長因子的信號有關。但存在血管管腔粗大、內皮細胞扁平等情況，不符合增殖期血管瘤的特征。

Tan等[29]將人血管瘤組織切片包埋在纖維蛋白凝膠，置于培養板內培養，并加入少量無血清緩沖鹽培養液，觀察到血管瘤組織邊緣長出了微細的血管，不同階段的血管瘤組織出現血管的時間不同：增殖期最早，在1～4 d就可觀察到，消退期5～7 d，消退完成期7～12 d。該實驗還證實了培養的血管瘤組織保留了在體內時的一些生物學特性（如內皮細胞、肥大細胞的表型和數目，基底膜的組成，生長因子的表達等）。江成鴻等[30]則改進了這種方法，降低了凝膠中纖維蛋白原的濃度，并加入10%胎牛血清，同樣觀察到了組織塊邊緣生長出“枝芽狀”細小血管。這種模型對研究血管瘤的細胞、生化和分子機制以及藥物的作用機制有一定價值，但最長只能持續數周時間，且需要手術標本的支持。

6 展望

建立一個理想的血管瘤動物模型，對于研究血管瘤的發病機制和藥物作用機制，從而提高臨床療效，發現新的治療方法或途徑具有重要作用。然而，目前報道的大多數血管瘤動物模型都不能模擬血管瘤生長、消退的自然過程，而且不能表現出類似的組織病理特點。由于人類血管瘤并不發生在其他物種，進一步增加了建立動物模型的難度。隨著組織工程技術的發展，提取出血管瘤干細胞并移植在裸鼠體內，成功再現血管瘤的一些特征，有望成為現實。

[1]Bischoff J.Progenitor cells in infantile hemangioma[J].J Craniofac Surg,2009,20(Suppl 1):695-697.

[2]Ritter EJ,Goldman L,Richfield D,et al.The chicken comb and wattle as experimental model for investigative argon laser therapy of angiomas[J].Acta Derm Venereol,1969,49(3):304-308.

[3]Bautch VL,Toda S,Hassell JA,et al.Endothelial cell tumors develop in transgenic mice carrying polyoma virus middle T oncogene[J]. Cell,1987,51(4):529-537.

[4]Liekens S,Andrei G,Vandeputte M,et al.Potent inhibition of hemangioma formation in rats by the acyclic nucleoside phosphonate analogue cidofovir[J].Cancer Res,1998,58(12):2562-2567.

[5]徐骎,張志愿,陳萬濤,等.轉基因小鼠血管瘤動物模型建立[J].中華口腔醫學雜志,2003,38:355-357.

[6]Xu Q,Chen W,Wang Z,et al.Mice transgenic with SV40-latepromoter-driven polyomavirus middle T oncogene exclusively develop hemangiomas[J].Transgenic Res,2009,18(3):399-406.

[7]王延安,鄭家偉,費照亮,等.條件化轉染MT基因小鼠模型的建立[J].中華醫學遺傳學雜志,2006,23:62-67.

[8]Wang YA,Zheng JW,Fei ZL,et al.A novel transgenic mice model for venous malformation[J].Transgenic Res,2009,18(2):193-201.

[9]Williams RL,Risau W,Zerwes HG,et al.Endothelioma cells expressing the polyoma middle T oncogene induce hemangiomas by host cell recruitment[J].Cell,1989,57(6):1053-1063.

[10]Dubois-Stringfellow N,Kolpack-Martindale L,Bautch VL,et al. Mice with hemangiomas induced by transgenic endothelial cells. A model for the Kasabach-Merritt syndrome[J].Am J Pathol,1994, 144(4):796-806.

[11]Bussolino F,De Rossi M,Sica A,et al.Murine endothelioma cell lines transformed by polyoma middle T oncogene as target for and producers of cytokines[J].J Immunol,1991,147(7):2122-2129.

[12]Vergani V,Garofalo A,Bani MR,et al.Inhibition of matrix metalloproteinases by over-expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 inhibits the growth of experimental hemangiomas[J]. Int J Cancer,2001,91(2):241-247.

[13]Perry BN,Govindarajan B,Bhandarkar SS,et al.Pharmacologic blockade of angiopoietin-2 is efficacious against model hemangiomas in mice[J].J Invest Dermatol,2006,126(10):2316-2322.

[14]Bhandarkar SS,Jaconi M,Fried LE,et al.Fulvene-5 potently inhibits NADPH oxidase 4 and blocks the growth of endothelial tumors in mice[J].J Clin Inves,2009,119(8):2359-2365.

[15]Sidbury R,Neuschler N,Neuschler E,et al.Topically applied imiquimod inhibits vascular tumor growth in vivo[J].J Invest Dermatol,2003,121(5):1205-1209.

[16]Sausville J,Molinolo AA,Cheng X,et al.RCAS/SCL-TVA animal model allows targeted delivery of polyoma middle T oncogene to vascular endothelial progenitors in vivo and results in hemangiomadevelopment[J].Clin Cancer Res,2008,14(12):3948-3955.

[17]Tang Y,Liu W,Yu S,et al.A novel in vivo model of human hemangioma:xenograft of human hemangioma tissue on nude mice [J].Plast Reconstr Surg,2007,120(4):869-878.

[18]彭強,劉文英,唐耘熳.兒童毛細血管瘤裸鼠移植模型的制作研究[J].中華小兒外科雜志,2004,25:235-238.

[19]Peng Q,Liu W,Tang Y,et al.The establishment of the hemangioma model in nude mouse[J].J Pediatr Surg,2005,40(7):1167-1172.

[20]Lee RJ,Springer ML,Blanco-Bose WE,et al.VEGF gene delivery to myocardium:deleterious effects of unregulated expression[J]. Circulation,2000,102(8):898-901.

[21]Gualandris A,Rusnati M,Belleri M,et al.Basic fibroblast growth factor overexpression in endothelial cells:an autocrine mechanism for angiogenesis and angioproliferative diseases[J].Cell Growth Differ,1996,7(2):147-160.

[22]Kitajima S,Liu E,Morimoto M,et al.Transgenic rabbits with increased VEGF expression develop hemangiomas in the liver:a new model for Kasabach-Merritt syndrome[J].Lab Invest,2005,85(12):1517-1527.

[23]許振起,王衣祥,孟娟紅,等.重組腺相關病毒攜帶人血管內皮細胞生長因子121制備小鼠血管瘤模型的初步探討[J].中華口腔醫學雜志,2009,44:162-164.

[24]Boye E,Yu Y,Paranya G,et al.Clonality and altered behavior of endothelial cells from hemangiomas[J].J Clin Invest,2001,107: 745-752.

[25]Walter JW,North PE,Waner M,et al.Somatic mutation of vascular endothelial growth factor receptors in juvenile hemangioma[J]. Genes Chromosomes Cancer,2002,33:295-303.

[26]Khan ZA,Boscolo E,Picard A,et al.Multipotential stem cells recapitulate human infantile hemangioma in immunodeficient mice [J].J Clin Invest,2008,118(7):2592-2599.

[27]Spitsbergen JM,Tsai HW,Reddy A,et al.Neoplasia in zebrafish (Danio rerio)treated with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine by three exposure routes at different developmental stages[J]. Toxicol Pathol,2000,28(5):716-725.

[28]Van Dyck F,Scroyen I,Declercq J,et al.aP2-Cre-mediated expression activation of an oncogenic PLAG1 transgene results in cavernous angiomatosis in mice[J].Int J Oncol,2008,32(1):33-40.

[29]Tan ST,Hasan Q,Velickovic M,et al.A novel in vitro human model of hemangioma[J].Mod Pathol,2000,13(1):92-99.

[30]江成鴻,莊福連,黃拔瑞.一種三維血管瘤血管生成體外培養模型的建立[J].中華整形外科雜志,2005,21:364-366.

R732.2

B

1673－0364（2010）02－0114－04

2009年12月18日；

2010年2月26日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.016

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院·口腔醫學院口腔頜面外科。

鄭家偉。