白色念珠菌毒力因子的蛋白質組學研究進展

王斌，曾明，王雪松，袁靜

白色念珠菌（Candida albicans）是人體皮膚黏膜的正常寄生菌，也是臨床上重要的條件致病性真菌。它可引起皮膚、黏膜及內臟的念珠菌病，是免疫力低下宿主感染的重要致病真菌之一，可導致淺表或深部的白色念珠菌病。近年來，器官移植免疫抑制劑、廣譜抗生素的使用、癌癥放療化療的增多、各種生物裝置的體內置入和導管的留置、廣譜抗菌藥物的濫用和艾滋病的流行等，使得免疫功能低下者不斷增多，深部真菌感染作為一種并發病，感染率大幅上升，已成為這些疾病患者死亡的主要原因。同時由于白色念珠菌為真核生物，其生物化學代謝途徑與人類宿主有很高的相似性，很多抗真菌藥物都會有副作用或者只能抑制而不能真正殺死病原生物。因此，念珠菌病已經從輕微的感染成為現代生物醫學中重要的臨床問題。由于幾種常用抗真菌藥物（如兩性霉素 B、唑類藥物和一些新的細胞壁抑制藥）的效能降低、副作用較重、抗真菌類耐藥性的出現，以及缺乏準確和快速診斷方案[1-3]，使這種致命性條件致病菌的發病率在持續增長。因此，白色念珠菌的毒力問題一直廣受關注。

白色念珠菌既為正常菌又是條件致病菌，它能夠逃逸機體的免疫系統、治療藥物等，在合適的條件下進入機體組織內引起疾病。因而白色念珠菌的致病性和毒力可能是由一組因子決定，而不是由單一的物質決定的。白色念珠菌的幾種毒力表現為對環境變化的適應性（即表型轉換和二態性）、對宿主細胞及組織的黏附性及分泌水解酶等[4-6]。對其毒力因子的研究已成為蛋白質組學的主要研究內容，試圖揭示白色念珠菌由正常菌變為致病菌的機制，從而控制白色念珠菌感染、發現新的疫苗或能夠有更好治療作用的抗真菌藥物的靶標。

1 白色念珠菌的白-灰轉換

1.1 轉換系統

白色念珠菌的白-灰轉換是自發的，而且很常見，由光滑、白色、橢圓的菌落（白色期）轉變為扁平、灰色、細長或豌豆型的菌落（灰色期），除了菌落形態上的轉化，還有其他表型的轉換，如抗原的表達，對人類上皮細胞的黏附，對嗜中性粒細胞氧化劑的敏感性，活性蛋白酶的分泌，酵母-菌絲轉換中的環境約束及對藥物的敏感性等[4]。因此，這種表型轉換極有可能使白色念珠菌具有既能是正常菌又可能是致病菌的獨特的適應性，使白色念珠菌能很快適應環境或身體內的特殊部位條件的改變，侵入組織內，逃避免疫監控和（或）發展為藥物耐受。

1.2 轉換的蛋白質組學研究

表達譜蛋白質組學等方法已經用于白色念珠菌白色期與灰色期細胞蛋白質全譜的比較，以期檢測到某一期內的有調控功能又能夠闡明其中機制的單一蛋白[7-8]。Prasad 等[7]用同位素標記白色期和灰色期的胞質蛋白進行的蛋白質組學研究發現白色期有 1 個特異的蛋白點，而灰色期有2 個。他們進一步對從白色期和灰色期分離的 mRNA 的體外翻譯表達產物進行了雙向電泳（2-DE）比較分析，同樣證明了灰色期特異的 mRNA 翻譯表達出的蛋白質，共有3 個蛋白點的差異[8]。由于白-灰形態轉換時的轉換在細胞表面及抗原表達中都存在，可以推測對細胞壁的蛋白質組學研究，以及對這兩期細胞的其他假想的相關蛋白的蛋白質學研究一定會鑒定出新的轉換相關蛋白。

2 酵母-菌絲轉換

2.1 白色念珠菌的多形性

白色念珠菌是一種多形性的生物體，形態學上可以包括：①酵母樣出芽細胞；②假菌絲；③菌絲或菌絲體；④厚壁孢子。酵母樣出芽細胞到菌絲轉換最初的形成階段是芽管的形成。在特殊的宿主環境的刺激下，酵母與菌絲生長之間的轉換能力，決定著白色念珠菌的侵襲力。這 2 種形態在臨床損害中都存在，可能在致病過程中都發揮作用，而菌絲能夠更牢固的黏附宿主細胞，可以促進組織滲透[9]。由于菌絲的向觸性和向藥性，菌絲能夠發現上皮和內皮的破損表面并進行滲透，侵入宿主組織。在體外模擬實驗中發現這種二態性可以由許多環境條件來調節，如溫度、pH及營養狀態（血清、N-乙酰氨基葡萄糖、脯氨酸等）[10]。

近年來，已經建立了大量白色念珠菌酵母和菌絲蛋白的2-DE 參考圖譜[11-15]，可以進一步直接分析酵母-菌絲轉換過程中表達物的改變?，F已鑒定到很多與代謝、能量產生、轉錄因子及熱休克反應相關的蛋白。

2.2 二態性轉換的進化

自從1980年起對白色念珠菌進行蛋白質組分析以來，幾組研究人員[11,16]已經利用表達蛋白質組學為基礎的手段揭示了酵母-菌絲轉換相關的蛋白，并且注意到形態發生的機制及對毒力的間接影響，通過 2-DE 對白色念珠菌酵母細胞和菌絲的全蛋白質組學或特異的亞蛋白質組學進行定性和定量的比較，分別獲得蛋白表達的差異以及蛋白表達水平的數據，然后通過質譜鑒定出二態性轉換相關的蛋白[17]。

大多數全細胞蛋白樣品的 2-DE 圖譜分析沒有發現白色念珠菌的菌絲體細胞存在重新合成的蛋白質[18]。雖然在溫度調控的二態性的圖譜中，以及通過進一步的免疫吸收和絲狀體缺失菌株試驗中，發現了 33 個酵母特異性胞質蛋白點和 10 個菌絲特異性胞質蛋白點，但只是發現這些“菌絲體特異”蛋白實際上是在酵母中蛋白質的修飾體，在酵母和菌絲體免疫蛋白質組學研究中也得到相似的結果。Brown和 Chaffin[19]按白色念珠菌形態發生的不同時間段進行了詳細的亞蛋白質組學分析，檢測到 5 個酵母特異性蛋白點及 2 個下調的菌絲蛋白點，解釋了菌絲體特異蛋白的缺乏是由于形態發生時基因表達的改變，而不是由于已存在于出芽細胞蛋白的修飾形式。

從總體看，在未經純化的全細胞蛋白的 2-DE 圖譜上很難看出白色念珠菌不同形態發生階段的差別。有人構建了菌絲體缺陷型，用 pH 調節二態性進行蛋白質組學分析，只分辨出 1 個酵母特異性蛋白和 1 個菌絲特異性蛋白。導致這種不顯著變化的原因可能是翻譯后修飾、轉化率或是由于 2-DE 技術不能檢測低豐度調控蛋白的缺點造成的。同樣，依賴 pH 的葡萄糖和半乳糖誘導的芽管和不依賴 pH的N-乙酰氨基葡萄糖誘導的芽管的 2-DE 圖譜中蛋白表達的差異也比較少。由于白色念珠菌生長或 pH 特異性的蛋白的表達不受形態發生因素的影響，因而也沒有發現與形態有關的獨立的蛋白。這些蛋白質組學發現表明，大量涉及二態性的蛋白在細胞內似乎是一種低水平表達或是短暫出現。因此，研究者開始剖析一些關鍵的亞蛋白質組學，而不是全蛋白質組學，去研究關于兩種形態建立的線索[11,16]。

Choi 等[18]在對血清和溫度調控的二態性的菌絲胞質蛋白的蛋白膠圖中可見的 11個上調蛋白點中的 6 個蛋白點用 MALDI-TOF-MS 鑒定出了 3 種蛋白質，其中 Pra1p（pH 調節抗原）和 Phr1p（pH 應答蛋白）首先被圈定為涉及形態發生的分子。這 2 種蛋白在菌絲細胞中糖基化程度很高，而缺失突變株的比較蛋白質組學研究表明，Pra1p的表達依賴 Phr1p 的存在，說明 PRA1 基因可能位于PHR1 基因的下游。但是，這種調節機制對菌絲轉換的作用效果還需要進一步的研究。目前已知幾種轉錄因子和介導其信號轉導的蛋白能夠調控酵母和菌絲特異性基因的表達[20]，Niimi 等[21]利用肝素的陰離子特性，帶有 DNA 結合活性的蛋白可以通過肝素-瓊脂糖親和層析被分離出來，證明了一些 DNA 結合蛋白包括 DNA 結合復合物中的蛋白，在二態性轉換期間的合成是不同的。這表明在 S100 層析柱中檢測不到的低豐度蛋白可能是細胞對白色念珠菌早期芽管形成有關的生理應答、相關的細胞周期和形態發生中的變化起關鍵作用的調控因子。

白色念珠菌酵母-菌絲轉換包括了細胞壁的組織和成分的變化。大部分細胞壁蛋白中的蛋白可以根據它們與其他細胞壁結構成分的相互作用而分離出來。這種細胞壁蛋白經過富集后蛋白質組學分析，揭示了發生在酵母-菌絲轉換期間的細胞壁變化與細胞壁蛋白組成的數量及性質變化都是密切相關的[11]，在出芽和絲狀體中的調控是不同的，2 種形態的細胞壁蛋白與胞壁多糖（β-葡聚糖和殼多糖）的共價結合也不同。這些顯著的現象闡明細胞壁蛋白-殼多糖的連接很可能是大多數細胞壁蛋白共價吸附菌絲細胞壁的保持機制。用 MS 及 MS-MS 聯用方法在酵母和菌絲細胞中鑒定出了 15 種不同調控的細胞壁蛋白，發現了菌絲體壁上有些糖酵解的酶有很強的表達，而且不論是新的結構裝入細胞壁還是局部的細胞壁組成成分間的共價結合都在芽管形成時發生。

Urban 等[22]通過不滲透膜的生物素結合的親和純化的蛋白質組學方法，也獲得了白色念珠菌細胞壁蛋白與酵母和菌絲細胞的非共價連接的表達差異。盡管在 2 種生長形式的中發現了 26 個不同的細胞壁蛋白，而在 2 種形態中都發現了 4 種細胞壁蛋白，但只有 1 種蛋白——硫醇特異性抗氧化劑樣蛋白（Tsa1p）——證實了在二態性轉換期間的表達差異，發現 Tsa1p 定位在酵母形式的細胞核和細胞液內，在菌絲中這種蛋白定位有部分轉移到細胞的表面，說明它在細胞壁的表達可能被不同的移位作用所調控。

3 黏附作用

3.1 過量的宿主識別生物分子

黏附是致病過程的關鍵步驟，也是定植的必需條件，是重要的入侵前奏。許多真菌細胞的表面成分或基團，如特異性受體、疏水性蛋白質或寡聚蛋白，可以介導白色念珠菌與上皮或內皮細胞、細胞外基質蛋白（如層黏連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白）、血清蛋白（如纖維蛋白原、維蛋白溶酶原、iC3b 和 C3d 補體片段）、植入宿主體內的醫療器具（形成所謂的生物膜）等結合，這些識別宿主的生物分子被稱為黏附素。它們可變性提示了白色念珠菌侵襲和定植位點的多樣性[23-24]。

3.2 新型宿主識別生物分子

科學家的最初研究集中在“結構蛋白質組學”，應用這種技術可以同時篩選白色念珠菌的細胞表面蛋白，這些蛋白可以與宿主配體通過蛋白-蛋白相互作用進行識別和介導附著，即黏附素配體相互作用。隨著 2-DE 和應用特異抗體的蛋白質印跡技術的發展，蛋白質組技術為白色念珠菌中發現與黏附相關的新蛋白或基團特性的分析作出巨大貢獻[25-27]。

3.2.1 纖維蛋白溶酶原結合蛋白 與其他微生物病原體一樣，白色念珠菌可能黏附宿主的纖維蛋白溶酶原并且誘導其激活，隨后觸發宿主衍生的蛋白酶水解系統，能夠潛地增加真菌對組織的侵襲和分解作用，如白色念珠菌穿過體外血-腦脊液屏障的能力會由于纖維蛋白溶酶原的活性形式——纖維蛋白溶酶的存在而增強[28]。

Crowe 等[25]應用 2-DE 和隨后的配體與纖維蛋白溶酶原印跡技術、MALDI-TOF MS分析時，在白色念珠菌細胞壁蛋白抽提物中鑒定出 8 種蛋白質（4 個糖酵解和 1 個發酵相關的酶，2 個氧化還原蛋白，1 個延伸因子），具有與纖維蛋白溶酶原結合能力，其中大部分是具有 5 個羧基末端含有賴氨酸殘基的細胞壁蛋白。同時這些結果也得到了生物化學試驗的支持，證明了纖維蛋白溶酶原與細胞壁蛋白的結合依賴于這些殘基，而不是甘露糖蛋白的糖基基團，因為這類結合：①受賴氨酸類似物 εACA 的抑制；②用堿性羧基酶處理后結合力降低；③在蛋白糖基化缺陷的白色念珠菌突變體中保守。其他的功能分析表明，結合到白色念珠菌細胞表面的纖維蛋白溶酶原可能被宿主纖維蛋白溶酶原激活子激活為纖維蛋白溶酶。雖然纖維蛋白溶酶與白色念珠菌結合后能夠在體外降解纖維蛋白，但并沒有增加在穿透和損傷內皮細胞、侵入內皮基質方面的能力，因此，還需要進一步研究纖維蛋白溶酶原的激活在白色念珠菌體內侵襲過程中的作用。

3.2.2 泛素化的細胞表面受體 在白色念珠菌中表達的特異表面受體中，整合素樣受體能夠應用 RGD 序列通過蛋白-蛋白相互作用結合宿主蛋白，這類整合素樣受體包括層黏連蛋白、纖維蛋白素原、纖連蛋白、iC3b 和 C3d 補體片段等[29]。2-DE、多克隆抗體抑制泛素和 3個純化的整合素樣受體蛋白的抗體做的免疫印跡實驗都表明了白色念珠菌的表面受體是泛素化的。泛素化修飾在調節這些受體活性中發揮了主要作用，并且因此而影響到白色念珠菌對宿主結構的黏附作用。

3.2.3 疏水性蛋白質 細胞表面疏水性似乎在黏附宿主細胞、細胞外基質蛋白和導管以及躲避吞噬細胞的監視方面發揮了重要作用。Singleton 等[30]應用疏水相互作用色譜、高效液相色譜、2-DE、免疫印跡、LC-MS/MS等方法，鑒定出了 Csh1p 蛋白（38 kD 的細胞表面疏水蛋白），此蛋白是新的、功能未知的白色念珠菌基因產物，能夠介導與宿主蛋白配體的結合[31]。

4 胞外水解酶的產生

4.1 廣泛的底物特異性

白色念珠菌能夠產生與毒力相關并且具有廣泛底物特異性的胞外水解酶，如分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）、磷脂酶和脂肪酶等。在芽體和絲狀體形式的菌體中都發現了這些酶，它們分別提高了宿主表面點狀腔的糜爛和在酵母菌絲中的滲透性生長。這些水解酶可能有助于細菌滲透和侵襲宿主屏障、黏附到宿主黏膜表面、使宿主防御分子失活，并可以通過水解作用將聚合物分解為營養源[32]。白色念珠菌的胞外蛋白水解活性歸因于 Sap 的存在，Sap 是由 SAP 基因家族的 10 個基因編碼的，這些 Sap（特別是 Sap酶譜中的主要同功酶 Sap2p）能夠水解多種宿主底物，包括結構蛋白、蛋白酶抑制物、級聯系統中的蛋白、體液防御蛋白、細胞表面蛋白、細胞外基質等[32-33]。

4.2 白色念珠菌胞外蛋白的水解活性

通過在白色念珠菌細胞培養基中添加黏蛋白作為氮源或碳源，富集培養濾液進行蛋白質組學分析，可以鑒別作為主要黏蛋白降解酶的 Sap2p，也可以檢測少量的可能是黏蛋白分解產物的蛋白質。黏蛋白分解時可以觀察到它的 N 末端氨基酸序列與成熟的 Sap 無同源性，而且其酶譜和代謝標記均為陰性。白色念珠菌 Sap2p 的胞外黏蛋白分解活性可以用酶譜方法進行測定。此外，以前報道過小鼠空腸灌胃接種白色念珠菌，這種體外研究更加提示了 Sap2p 能夠作為酶負責體內黏蛋白層的進行性的胞外消化。

5 結語

白色念珠菌的毒力因子和致病機制非常復雜，但是目前已完成白色念珠菌的基因組測序和注釋。近年來，已經完善了對白色念珠菌生物學和病原特性的解釋，一些重要的結果是通過運用高通量的蛋白質組學方法獲得的，揭示了白色念珠菌是如何在分子水平上發揮作用的，而這些作用僅靠基因組學的研究是無法預料的。因此，從分子水平研究有機體的功能生物學也隨著技術的提高得到了快速發展。隨著對白色念珠菌的黏附素、磷脂酶等毒力因子以及其與細菌、巨噬細胞等相互作用研究的深入，白色念珠菌在黏附有機物表面或活組織后是如何將信號傳導到細胞核導致基因進行協調表達的等過程將會逐步被揭開。對這種相互作用網絡的了解，必將對白色念珠菌感染的預防和治療提供有益的線索。

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