細菌耐藥性分子機制的研究進展

夏永祥,陳 杰

(南京醫科大學附屬南京第一醫院,江蘇南京210006)

目前,感染性疾病的治療主要依賴于抗菌藥物。然而,隨著抗菌藥物的廣泛應用,細菌耐藥性日益引起關注。2001年,我國重癥監護室從患者體內分離的金黃色葡萄球菌對青霉素、慶大霉素、紅霉素、環丙沙星、氯霉素和四環素的耐藥性分別達99.5%,67.7%,84.7%,76.0%,34.0%和64.8%[1]。同時,多重耐藥菌的出現,如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、革蘭陰性桿菌中產生超廣譜β內酰胺酶大腸埃希菌[2]、青霉素耐藥肺炎鏈球菌和萬古霉素耐藥腸球菌等,對人類健康也形成了較大的威脅。耐藥細菌對人類健康構成的威脅已經不亞于艾滋病、癌癥和心血管疾病[3]。細菌耐藥性是全世界所面臨的重大挑戰,各國都在致力于對耐藥細菌的研究。本文就細菌耐藥性產生的分子學機制進行概述。

1 概述

1.1有關概念除了細菌會產生耐藥性外,真菌、支原體等微生物也存在耐藥性問題。這里主要講細菌。抗生素是抗感染藥物最重要的一類,其含義較狹窄。這里使用“抗生素”代表“抗菌藥物”、“抗微生物藥物”、“抗感染藥物”等概念。消毒劑也屬于藥物,但一般只用于環境和物品的藥劑;而抗生素用于人體,通過血液吸收和運輸而發揮作用。細菌的耐藥性包括對這兩大類與之作用的藥劑的耐藥性和抗性。“耐藥性”常用于抗生素,“抗性”常用于消毒劑。本文統一使用“耐藥性”,因其本質含義是一致的。細菌對某抗生素或消毒劑的耐藥性也可以簡述為某抗生素或消毒劑耐藥。

1.2細菌耐藥性普遍存在流行病學調查不僅在醫院臨床,而且在社區,細菌耐藥性普遍地存在,并且有的地區社區的耐藥性要比醫院內高。藥物對耐藥菌的臨床療效降低或無效,對感染性疾病尤其是危重癥感染患者構成威脅[4]。隨之而來的是,為治療耐藥性細菌感染的花費不斷增長,美國每年治療耐藥性細菌感染費用為40多億美元[5]。人類正面臨著“抗生素危機”,有人預測會出現“無藥可用”的可怕局面。耐藥性的發展趨勢,從細菌來講,呈現單一耐藥到多重耐藥趨勢;從藥物來講,呈現低耐藥率到高耐藥率的趨勢;發展速度是越來越快。以對喹諾酮類藥物的耐藥性為例,1995年北京地區臨床分離的菌株,大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌對諾氟沙星耐藥率分別為32%和32%,對環丙沙星耐藥率分別為58%和49%[6]。1996年武漢地區大腸埃希菌對環丙沙星耐藥率達44%[7]。1997年上海瑞金醫院報道大腸埃希菌對氟喹諾酮類耐藥率已超過50%[8]。1997年解放軍總醫院報道大腸埃希菌對環丙沙星的耐藥率從1994年的41.9%上升至1997年達60.4%[9],可見其耐藥發展之快。目前,耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRP)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)、產超廣譜β-內酰胺酶(ESBL s)的革蘭陰性桿菌、持續高產I型β-內酰胺酶(Amp C)的革蘭陽性桿菌的耐藥問題是非常突出的[10]。

1.3耐藥性產生的主要外因抗生素在感染性疾病的治療上發揮著重要作用,但由于各種因素使得抗生素使用的規范被忽視,導致抗生素被濫用。現在各種藥店和商場可以隨意購買抗生素;在飼料中加抗生素也很常見。隨著濫用越來越嚴重和普遍,細菌耐藥性也越來越嚴重和普遍;而且細菌的多重耐藥性增加、致病力增強。雖然人類可以生產更多更新的抗生素來對付細菌,但細菌產生耐藥性的變異速度更驚人(幾小時或幾天),而生產一種新抗生素從研究到臨床使用至少需要幾年。濫用抗生素越嚴重,細菌的變異速度和適應能力也就越發展。同時,人們衛生觀念的“提高”,使消毒劑的不合理應用也日益嚴重,更加重了細菌耐藥的狀況。這些情況可以稱之為選擇性壓力[11]。

2 遺傳學機制

2.1染色體介導的耐藥染色體介導的耐藥,是指細菌本身所固有的耐藥性或通過染色體突變產生的耐藥性。這種耐藥性的產生受細菌染色體DNA的控制,是同屬細菌的共同特征,如腸球菌耐頭孢菌素類藥物。這些細菌耐藥性的產生是細菌細胞所固有的,與細菌的遺傳和進化密切相關。微生物在遺傳進化過程中,普遍存在自發基因突變的現象,其結果可以導致細菌某些表型和功能的喪失,或獲得新的功能,以對抗抗生素的作用。對于耐藥性而言,如果編碼抗菌藥物作用靶位的核苷酸發生點突變,導致轉錄的靶位蛋白空間構象發生改變,其物理化學性質也可以隨之發生變化,結果使藥物與靶位之間的結合力下降或喪失,而使細菌產生耐藥性。

2.2質粒介導的耐藥為獲得性耐藥,并且所獲得的耐藥基因易于傳播。目前該類耐藥在臨床上占有重要地位。質粒是位于細菌染色體之外的具有自主復制能力的一種環狀DNA,長度在10 kb-1000kb之間。其編碼的基因功能并不是宿主細胞生長所必須的,但可以賦予細菌某種表型,其中耐藥性就是典型的例子。質?？梢酝ㄟ^接合或轉導作用在不同的細菌之間進行轉移。目前,發現最多的是質粒介導的對抗生素具有較強水解作用的AmpC酶(AmpCβ-lactamase)、超廣譜 β-內酰胺酶(extended-spectrum βlactamases,ESBLs)和碳青霉烯酶等[12]。在有的醫院現在已經發現在一個質粒上含有ESBLs和AmpC酶,稱為超超廣譜β-內酰胺酶(Super-spectrum β-Lactamase,SSBL)[13]。到2002年已報道的質粒AmpC類頭孢菌素酶就有20多種,并且呈世界性分布[14]。

2.3轉座子介導的耐藥性轉座子(transposon,Tn)又名跳躍基因,一種比質粒更小的DNA片段,它可以在染色體中跳躍移動,或在同一細胞中的染色體與質粒間移動,通常通過復制插入到新的位點,也可以將自身從原位點剪切掉再插入到新的位點,使結構基因的產物大量增加,從而使宿主細胞失去對抗菌藥物的敏感性。Tn還可以使位于染色體上和非接合質粒上的基因轉移到接合質粒中,因此實現細菌間的基因轉移或交換。在細菌對萬古霉素(Van)的耐藥性機制研究中發現vanA基因存在于Tn1546中。這一轉座子含有9個基因,其中包括2個編碼萬古霉素耐藥基因的“vanA基因簇”[15-16]。有些情況下,耐藥基因的轉移以轉座子、整合子和質粒等可移動的遺傳元件介導,易于傳播也常見。整合子是近年來發現的新的可移動基因元件,可捕獲和整合細菌的耐藥基因,在細菌耐藥性的傳播和擴散中起到了至關重要的作用。整合子可在不同細菌中水平傳播,在同一類整合子上可攜帶不同的耐藥基因盒,同一個耐藥基因又可出現在不同的整合子上。細菌的耐藥基因可以在在不同的整合子中移動,介導多重耐藥的形成[17]。

3 生物化學機制

3.1產生滅活酶或鈍化酶細菌可以產生滅活酶或鈍化酶來滅活或修飾進入細菌細胞內的抗菌物質,使之失去活性。如腸桿菌可攜帶ereA基因和ereB基因表達紅霉素酯酶使紅霉素酯解失活,由mphA,mphB和mphC基因編碼的紅霉素磷酸轉移酶,其表達產物可使紅霉素脫氧二甲胺己糖C-2′位置發生磷酸化或糖基化而失活[18]。細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥性主要是由于細菌產生的氨基糖苷類修飾酶(Aminoglycosides modifying enzymes,AME)對抗菌藥物分子中某些抗菌活性所必需的基團進行修飾,使其與作用靶位核糖體的親和力大為降低而出現耐藥性。1983年分離到的大多數耐藥菌僅對某一類氨基糖苷類抗生素產生耐藥,而最近調查發現大多數的耐藥菌含有多重耐藥機制,其中最多的含有6種AME[19]。

3.2對抗菌藥物的滲透障礙由于細菌細胞壁的障礙或細胞膜通透性的改變,抗生素無法進入細胞內到達作用靶位而發揮抗菌效能。細菌通過胞外膜通透性的下降,而阻礙抗生素進入細菌內膜的靶位,減少抗生素吸收。革蘭氏陰性菌膜通透能力變化較大,在抗生素的壓力下膜孔蛋白通道變得非常狹窄,從而對大分子化合物的穿透形成有效屏障。亞胺培南等抗菌藥物需穿透銅綠假單胞菌細胞膜上的微孔方能到達作用的靶位。當銅綠假單胞菌編碼微孔蛋白的oprD2基因發生缺失突變時,細胞膜上微孔缺失,亞胺培南無法進入胞內而失去作用[18]。

3.3主動外輸機制銅綠假單胞菌對多種常用的抗生素耐藥,主要是由于其外膜存在著獨特的藥物泵出系統,可以將進入胞內的藥物泵出胞外而致耐藥[18]。藥物外輸機制是微生物對藥物產生耐藥性的又一個重要機制,它是由藥物外輸泵來完成的。藥物外輸泵是一類位于細胞膜上的由內膜轉運蛋白、內膜融合蛋白及外膜通道蛋白一起形成的功能性膜轉運蛋白質[20]。其作用機理是當細胞內的藥物濃度聚集到一定程度,藥物外輸泵系統相關mRNA的表達增加,結果使細胞膜上外輸泵的數量增加,使細胞內的藥物被泵出,從而使菌體內藥物濃度降低而導致耐藥[21]。外輸系統可能是細菌在進化過程中形成的一種細胞自身解毒系統,在細菌基因組中,一般都存在外輸系統的調節基因。

3.4作用靶位的改變作用靶位改變后會使抗生素失去作用位點。靶位的改變包括親和力降低和替代性途徑的取代作用,可通過產生誘導酶對菌體成分(抗生素的作用靶位)進行化學修飾,或通過基因突變造成靶位變異而引起[22]。喹諾酮類的作用靶位有2個,DNA旋轉酶及拓撲異構酶Ⅳ,兩者均參與DNA的復制。對于結核分支桿菌缺乏拓撲異構酶Ⅳ,只有DNA旋轉酶一個靶位。對于2個靶位的作用強度,革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌不同,對于大腸埃希菌等革蘭氏陰性菌,環丙沙星等品種的主要作用靶位為DNA旋轉酶,次要靶位為拓撲異構酶;對于葡萄球菌等革蘭氏陽性菌,環丙沙星等品種的主要作用靶位為拓撲異構酶,次要靶位為DNA旋轉酶。細菌對喹諾酮類的敏感性由主要作用靶位決定,主要靶位的點突變可引起細菌對喹諾酮類敏感性的降低,多個點突變或同時存在次要靶位的突變使耐藥程度進一步上升[23]。

3.5細菌產生抗菌藥物的頡頏物細菌可以通過代謝頡頏劑產量的增加來抑制抗生素,從而獲得耐藥性。有些細菌能利用一定的酶系統(如二氫葉酸合成酶等),把對氨基苯甲(paminobenzoate,PABA)合成為它們生活所必需的葉酸,以維持自身的生長需要。由于磺胺類藥物在化學結構上與對氨基苯甲酸極為相似,當兩者同時存在,磺胺類藥物濃度較高時,即可深入細菌體內競爭二氫葉酸合成酶,生成異常的核酸擬似物,使細菌不能生成菌體所必需核酸而死亡。然而對磺胺類藥物產生耐藥性的細菌,可通過調整代謝環節,產生大量的對氨基苯甲酸,抵消磺胺藥對酶的競爭,從而使藥物失去抑菌作用[24]。耐藥金黃色葡萄球菌通過增加20倍-100倍的對氨基苯甲酸產量,從而耐受磺胺類藥物的作用[25]。

3.6生物被膜的形成細菌生物膜(bacterial biofilm)是細菌在生長過程中為適應生存環境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細胞相對應的生長方式,由細菌和自身分泌的胞外基質組成,它能夠阻止藥物滲透到細菌細胞內。銅綠假單胞桿菌形成的生物膜是近幾年來引起國內外許多學者高度重視的一種細菌群體性生物學特征。生物膜的多細胞結構可以在不同時間和空間發展,容易受外界環境影響[19]。當細菌吸附于活性固體表面時它能夠分泌胞外多聚物形成生物膜,生物膜具有極強的黏附性和耐藥性,能夠抵抗百倍以上的正常劑量的藥物。細菌的遺傳性耐藥水平較高,則形成生物膜的能力較弱。原因可能是耐藥水平較高的細菌本身對藥物就不敏感,因此藥物不易誘導細菌形成生物膜;相反,藥物敏感株卻容易被誘導形成生物膜,加大對藥物的耐受程度。所以,細菌生物膜的形成有可能是被藥物誘導的,而且細菌耐藥水平越高形成生物膜的能力就相對較弱[26]?？傊?生物膜形成發展的基礎研究還存在很多困擾問題,需要進一步深入。

3.7細菌代謝狀態的改變呈休眠狀態的細菌,或細菌營養缺陷菌均可出現對多種抗生素耐藥。

4 防止細菌產生耐藥性初步構想

細菌耐藥性的產生機制極為復雜,一個耐藥菌株對同一種藥物可同時具有多種耐藥機制;同時,一個耐藥菌株也可同時具有多種耐藥基因,而引起對多種藥物同時耐受,所以控制和減少耐藥性細菌的產生已成為擺在人們面前的一個嚴峻問題。為了防止細菌耐藥性的產生,可以采取以下幾種措施:(1)有效控制抗生素的使用。合理用藥,最大限度地減少細菌的選擇性壓力,嚴格控制抗生素藥物用于預防感染,調整抗生素的應用結構,控制新型抗生素的應用。(2)減少抗生素在人畜中的使用。在食品動物中使用抗生素與病原菌出現耐藥性之間有一定的聯系,這些耐藥性病原菌進入食物鏈后會影響人和動物的健康,所以應該開發動物用藥指南,減少抗生素在食用動物中的濫用和誤用。(3)開發治療感染的非抗菌素類新藥。開發作為人類天然抵抗感染的抗菌肽。(4)促進疫苗的研發,鼓勵開發新的特異性強的疫苗。

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