周圍神經損傷后軸突再生的分子機制研究進展

高潔,劉良明,伍亞民

周圍神經是連接中樞神經系統和外周靶組織器官信號通路的中介結構。周圍神經損傷后,表現為神經元胞體的改變、神經纖維變性和微環境的改變,及靶組織器官的潰變。在損傷信號的傳遞中涉及損傷信號快速傳導,并有相關轉錄因子、黏附分子、生長相關蛋白以及軸突再生的結構成分反應。成年哺乳動物的周圍神經表現出旺盛的再生能力,而中樞軸突損傷,無論其胞體是否在中樞,一般情況下皆無法再生。從神經的發育看,神經軸突沿特定的路徑延伸,到達將與它建立突觸聯系的靶細胞的胞體、樹突或軸突。在神經突起末端存在一個扇形結構——生長錐(axonal growth cone),它表面的受體能選擇性識別胞外環境中的導向信號,經過一系列信號轉導機制引起自身的伸展和回縮反應,從而指導軸突生長[1-3]。當周圍神經損傷后,神經纖維和周圍結締組織發生損傷反應,相應神經元依次發生神經元胞體腫脹,尼氏體消失,細胞核偏移,突觸終端減少;遠端軸突和靶組織器官發生華勒氏(Waller)變性而崩解,施萬細胞增殖,胞體軸突產生生長錐,開始在多因素調控下的再生過程。破解軸突再生障礙的分子、細胞機理業已成為近來神經再生研究的重點。目前認為,決定周圍神經軸突再生的策略主要包括:①神經軸突變性和再生信號通路的調控;②神經再生微環境的維持;③神經元軸突結構的構建。

1 周圍神經損傷后的軸突反應及信號通路

周圍神經損傷后,損傷神經局部主要產生3種明顯的反應。

1.1 神經支配靶器官的逆行性傳導受阻 神經生長因子(nerve growth factor,NGF)作為神經營養因子之一,從周圍逆向運輸至神經元胞體。坐骨神經損傷去軸突后,逆向運輸減少到近1/10,雖然持續時間僅為48 h,呈3倍性減少并一直持續到再生發生。本實驗室在研究大鼠坐骨神經損傷時發現,聯合應用NGF和睫狀神經生長因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)營養支持,對周圍神經的軸漿運輸功能的恢復優于NGF[4-5]。通過特異性抗體限制NGF內在活性可導致去軸突樣變化;其他如 c-jun,神經肽,包括 galanin、血管活化性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、P物質、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)和神經肽Y(neuropeptide Y,NPY)等[6]也有類似作用。

1.2 施萬細胞、炎性反應的分泌介質改變微環境 損傷軸突和靶組織及周圍非神經細胞(如成纖維細胞)含有眾多神經生長誘導和營養分子,包括CNTF、神經營養素3(neurotrophin-3,NT-3)以及成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors,FGFs)皆可于損傷后分泌。CN TF和核轉錄信號轉導因子和轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT3),即活化后CNTF受體的下游靶點,都有廣泛的信號調控作用。STAT3剔除可以增強傷后細胞死亡,提示STAT3具有神經營養性作用。敲除CNTF可延遲STAT3的磷酸化和神經細胞核轉位[7]。施萬細胞受損釋放CNTF,并作用于鄰近軸突局部,STAT軸突內磷酸化并逆向運輸至損傷神經元胞體。后期,軸突損傷后白細胞募集,炎癥細胞因子產生和鄰近非神經細胞產生神經營養因子、趨化因子、胞外大分子和合成蛋白水解酶,損害軸突致胞外環境改變。繼而是胞內信號分子活化,特別是控制細胞周期、分化、軸漿轉運分子和細胞骨架成分合成,及各種生長因子和細胞因子的分泌,此外,還有調控能量、氨基酸和脂質代謝的分子[8-10]。

1.3 細胞電位平衡改變 損傷信號源相互協同或者分別作用活化核定位信號(nuclear localization signal,NLS)序列的軸漿蛋白,引發創傷信號擴布[11-13]。

除上述損傷神經局部發生病理反應外,相應的神經元會發生跨突觸的變性,主要表現為神經元的變性壞死和/或凋亡。有研究證實,損傷神經細胞可出現包括fas和腫瘤壞死因子受體1和2(tumor necrosis factor receptors 1,2,TNFR-1,2)。除了TNFR-2,受體攜帶一種胞漿死亡區域,這種區域可以通過fas相關死亡結構蛋白(fas-assocaiated protein domain,FADD)釋放一種促凋亡信號。調控FADD可通過fas和TNFR去除后的細胞死亡信號。此外,實驗研究還發現,敲除Bax或抑制細胞凋亡蛋白酶3(caspase-3)或者caspases整個家族,可以阻止細胞死亡,多種caspase抑制因子中唯caspase-3作用強而持久。盡管目前的研究還有爭議,但總體而言,TNF及其受體、促凋亡的caspase-3等因素對周圍神經損傷后的跨神經元變性壞死和/或凋亡具有重要作用。下位靶組織器官也發生相應的潰變,一般認為,其機制與此類似。

軸突損傷后,除產生上述變性反應外,隨后也產生再生性改變,在形態上表現為生長錐的形成,相應神經元胞體及近端軸突合成代謝增強,如多胺生成酶(鳥氨酸谷胺酰轉胺脫羧酶)暫時上調,從而使腐胺、精胺、亞精胺促進在體和離體軸突生長[14]。絲裂原活化蛋白(mitogen-associated protein,M AP)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)級聯反應抑制 Raf、Ras、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-associated protein kinase kinase,MEK)、胞外信號調節激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase 1,2,Erk1,2)等信號分子均參與了上述再生性反應[15],Ras/Raf/MEK-PI3K信號通路被認為具有十分重要作用[16-17]。無論周圍神經損傷引起的變性改變還是隨后的再生性反應,都離不開神經元相應的基因表達變化,目前認為其最終影響核轉錄因子的表達及活性,包括轉錄因子的磷酸化和核轉位,這些轉錄因子主要包括 c-jun、junD、激活性轉錄因子 2、3(activating transcription factor,ATF)、P311、Sox11、STAT3 以及 islet-1、核因子κ B等,可能存在調控再生神經元基因表達的開關信號[18]。

2 周圍神經軸突的再生微環境及重要調控分子

正常神經元胞體及其軸突結構和功能由穩定的微環境來保障和維持。神經損傷后,周圍神經纖維內環境隨之變化,各種局部因素,包括神經膜細胞、巨噬細胞等重要的細胞成分,以及由各種細胞表達和分泌的眾多具有生物活性分子炎性介質、黏附分子和神經營養因子等對軸突再生、趨化生長、髓鞘再形成和突觸重建調控具有一定作用。

2.1 炎性分子 軸突損傷后,神經遠端和損傷神經元胞體周圍發生急性炎癥反應,表現為以白細胞為主的炎性細胞遷入,以協助清除胞體周圍變性壞死的施萬細胞及髓鞘碎片。這些局灶性炎癥細胞很快被激活,移入后直接接觸胞體,與監測損傷神經組織的T細胞相互作用。巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)缺乏導致小膠質細胞增生以及早期淋巴細胞重新募集減少,但不影響軸突再生速度;同樣,基因變異小鼠軸突損傷后,敲除神經營養因子受體P75NTR或者含SH結合域的酪氨酸蛋白磷酸化酶(SH-domain-containing protein tyrosine phosphates,SHP-1)可見炎性反應增強,無神經再生現象[19]。然而,一些研究顯示輕度正相關。

白細胞介素(IL)-6基因敲除明顯減少運動神經元去軸突后的炎癥反應,但也引起軸突再生速度的輕度下降。IL-6和其受體聯合過度表達導致神經再生增強;反之,面神經壓迫性損傷時,通過細胞形態學測定發現,遺傳性IL-6基因缺乏導致軸突再生速度減少15%,與坐骨神經壓迫損傷后的功能性行走實驗測定結果類似[14]。與周圍神經系統相比,IL-6對中樞的作用爭議很大。IL-6缺乏被認為可減少面運動核損傷模型中膠質疤痕形成,提高中樞軸突發芽;可加快脊髓損傷后的功能恢復,但條件性損傷誘導的脊髓軸突再生下降。這些研究提示,由炎性細胞和炎性因子介導的炎癥反應對中樞神經和周圍神經損傷后的再生微環境的調控可能具有不同的作用及不同的分子機制。

2.2 黏附分子 在神經系統發育過程中,細胞黏附分子(cell adhesion molecule,CAM)是介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間相互識別、黏附和信號傳導的重要信號分子。最近的在體研究比較關注層粘連蛋白α 7β1整合素受體和半乳糖凝集素(galectin)的作用。研究顯示,敲除編碼α 7整合素亞單位基因導致面神經軸突切割后運動軸突再生速度下降及周圍神經靶點重新支配約40%。同樣,jun基因缺陷小鼠損傷后,α 7并不上調,這似乎與這些動物軸突再生反應較弱有關。缺乏層粘連蛋白,即α 7整合素的配體會產生同樣但更顯著而持久的作用。γ 1層粘連蛋白鏈細胞的特異基因缺乏,即周圍神經施萬細胞中α、β、γ三聯體必要成分的缺乏,導致坐骨神經壓迫損害后進入末梢神經軸突的成分大量減少,持續 30 d;而α 7缺陷動物末梢神經軸突成分呈暫時性缺少。研究還注意到,α 7缺陷小鼠神經損傷后,β整合素上調非常顯著,與中樞軸突發芽明顯增長相對應。損傷誘導的神經軸突發芽后,細胞黏附分子如免疫球蛋白超家族成員 L1(l immunoglobulin-1,L1)和其高同源體(close homologue of L1,CHL1)與β 1整合素功能相關[20],而且可能與α 7缺陷小鼠在損傷中作用相同。

各種黏附分子包括整合素、半乳糖凝集素/CD46、67 kDa層粘連蛋白受體、細胞外基質受體α-dystroglycan(α-DG)1,4半乳糖轉化酶可能作為不同受體的配體過量表達。比如應用外源性galetin-1可以提高神經突生長速度;以抗體中和內源性galetin使其失效或者基因敲除降低速度。氧化型galetin-1也可刺激施萬細胞由近端向遠處殘端遷移,輔助橋接細胞,促進軸突向損傷神經末梢長入[21],提示其可能在周圍神經損傷后的軸突的生長、突觸的可塑性、神經纖維的成束發揮有意義的作用。

2.3 神經營養因子 很多研究已表明神經營養因子有一定的保護作用[22]。但也有一些研究證實,應用神經營養因子減少細胞存活。王永堂注意到,NGF毒性作用依賴于普通神經營養因子受體P75NTR。同樣,P75NTR的毒性作用也見于坐骨神經軸突再生[19],但未見于面運動神經。應用不同神經營養因子、生長因子和細胞因子已顯示出促進軸突跨越斷端空間的遠端和近端軸突生長。

影響神經末梢軸突再生速度主要是3組因子:①胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1);②神經營養因子(neurotrophic factors,NTFs),包括腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)超家族成員、膠質細胞源性神經營養因子(glial-cell derived neurotrophic factor,GDNF);③白血病抑制因子(LIF)。應用增強型外源性生長因子IGF-1、IGF-2和抗體可減少軸突再生速度。我們課題組觀察到,大鼠坐骨神經損傷后以IGF-1配合幾丁糖,傷后1個月治療組感覺功能恢復明顯(實驗資料整理中)。文獻報道,當BDNF和GDNF在周圍神經損傷末梢被活躍誘導時,去軸突的神經元受體表達隨著慢性離斷過程逐漸減少。應用BDNF和GDNF不能使損傷后軸突很快再生,卻可提高損傷后慢性去軸突的運動神經元軸突再生,BDNF/GDNF量如果不足可能導致慢性去軸突效應[23]。抑制內源性BDNF和GDNF也減少軸突損傷后周圍神經再生。

3 神經元軸突再生骨架結構的重建

細胞骨架成分的合成和轉運是神經生長錐形成和延伸的重要條件。神經損傷后再生也面臨骨架成分的變化,軸突完全再生常伴隨大量功能各異的分子家族出現,以調控細胞表面相互作用。生長相關蛋白43(growth associated protein-43,GAP-43)、丙氨酸烷化C激酶基質(myristoylated alanine rich C kinase substrate,ARCKS)、皮質細胞骨架伴隨蛋白 23(cortical cytoskeleton-associated protein,CAP-23)與磷酸共同分布于細胞表面的raft區域。這些分子結構多變,只結合于磷脂酸如PI-(4,5)-P2、鈣/鈣調節蛋白、蛋白激酶C和肌絲蛋白,并調節raft重新募集信號分子如非受體類酪氨酸激酶(sarcoma kinase,Src),調節肌動蛋白細胞骨架聚合、再分布和降解。鈣調節蛋白含鈣和不含鈣成分與上述分子相互作用,對于受體介導的鈣內流調控生長錐的活性有重要的連接作用;以尼莫地平抑制鈣內流可明顯增加軸突再生。神經損傷后,微管降解分子如SCG10、微管調控蛋白 stathmin、視網膜母細胞瘤蛋白3(retinoblastoma protein-3,RB3)和相關配合物皆是生長錐發育相關蛋白[22],例如萎陷反應誘導蛋白-2(collapsin response protein-2,CRMP-2),形成第2個軸突適應分子微管靶向群,在神經損傷后表達上調。CRMP-2神經過度表達可改善軸突再生[9]。微管相關蛋白1b(microtubule associated protein 1b,MAP1b)業已證實可直接介導感覺神經元再生時定向性生長錐遷移和軸突分枝。

在調節細胞骨架結構、動力學和細胞黏附等方面需要關注Rho GTP酶,其主要成員為 RhoA、Rac、Cdc42和 TC10,可作為分子開關調節細胞骨架再生構建[3]。GTP酶的活化是由與細胞表面受體連接的適應分子,如導向遷移分子slit-robo GTP酶活化酶蛋白 2介導。軸突損傷致 RhoA、Rac、Cdc42輕度上調和TC10的大幅增加。在體RhoA抑制激發中樞無軸突再生的正常誘導過程[1,4]。周期素依賴性激酶抑制劑 P21(Cip1/WAF1)與Rho激酶結合為復合體并抑制其活性,也促進中樞神經系統損傷后再生和功能恢復。促進P21表達的分子如核蛋白P311,也促進損傷運動神經再生,加速周圍神經靶點再分布[9]。并非每個周期素依賴性激酶都抑制再生,可能存在周圍神經損傷病灶軸突再生延長的屏障。

4 結論

研究周圍神經損傷后的損傷反應和成功再生反應的信號分子,重點探討相關信號通路及其調控機制,將有助于揭示促進軸突再生的內源性分子作用機制。目前開展的關于P75NTR和神經營養分子的系列研究結果提示,從分子信號通路入手有可能幫助我們解析修復損傷的周圍神經乃至中樞神經系統的復雜過程。

[1]Tom VJ,Sandrow-Feinberg HR,Miller K,et al.Combining peripheral nerve grafts and chondroitinase promotes functional axonal regeneration in the chronically injured spinal co rd[J].J Neurosci,2009,29(47):14881-14890.

[2]王正國,付小兵,周元國.分子創傷學[M].福州:福建科學技術出版社,2004:623-654.

[3]Joset A,Dodd DA,Halegoua S,et al.Pincher-generated Nogo-A endosomes mediate growth cone collapse and retrograde signaling[J].Cell Biol,2010,188(2):271-285.

[4]李強,伍亞民,李民,等.NGF與CN TF促進周圍神經電生理功能恢復的協同作用研究[J].中華物理醫學與康復雜志,2006,28(3):145-149.

[5]張玉波,伍亞民,楊桓文,等.神經生長因子促再生周圍神經血管生成的實驗研究[J].中國矯形外科雜志,2005,13(18):1410-1413.

[6]Shadiack AM,Sun Y,Zigmond RE.Nerve growth factor antiserum induces ax otomy-like changes in neuropeptide expression in intact sympathetic and sensory neurons[J].J Neurosci,2001,21(2):363-371.

[7]Schweizer U,Gunnersen J,Karch C,et al.Conditional gene ablation of Stat3 reveals differential signaling requirements for survival of motoneurons during development and after nerve injury in the adult[J].J Cell Biol,2002,156(2):287-297.

[8]Schmitt AB,Breuer S,Liman J,et al.Identification of regeneration-associated genes after central and peripheral nerve injury in the adult rat[J].BMC Neurosci,2003,4:8.

[9]Vogelaar CF,Hoekman M F,Gispen WH,et al.Homeobox gene expression in adult dorsal root gang lia during sciatic nerve regeneration:is regeneration a recapitulation of development?[J].Eur J Pharmacol,2003,480(1-3):233-250.

[10]Fujitani M,Yamagishi S,Che YH,et al.P311 accelerates nerve regeneration of the axotomized facial nerve[J].J Neurochem,2004,91(3):737-744.

[11]Spira ME,O ren R,Dormann A,et al.Calcium,protease activation,and cy toskeleton remodeling underlie growth cone formation and neuronal regeneration[J].Cell Mol Neurobiol,2001,21(6):591-604.

[12]Berdan RC,Easaw JC,Wang R.Alterations in membrane potential after axotomy at different distances from the soma of an identified neuron and the effect of depolarization on neurite outgrowth and calcium channel expression[J].J Neurophysiol,1993,69(1):151-164.

[13]Zheng JQ,Kelly TK,Chang B,et al.A functional role for intraaxonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons[J].J Neurosci,2001,21(23):9291-9303.

[14]Oble DA,Burton L,Maxwell K,et al.A comparison of thyroxineand polyamine-mediated enhancement of rat facial nerve regeneration[J].Exp Neurol,2004,189(1):105-111.

[15]Liu RY,Snider WD.Different signaling pathway s mediate regenerative versus developmental senso ry axon growth[J].J Neurosci,2001,21(17):RC164.

[16]Namikawa K,Honma M,Abe K,et al.A kt/protein kinase B prevents injury-induced motoneuron death and accelerates axonal regeneration[J].J Neurosci,2000,20(8):2875-2886.

[17]Heumann R,Goemans C,Bartsch D,et al.T ransgenic activation of Ras in neurons promotes hy pertrophy and protects from lesion-induced degeneration[J].J Cell Biol,2000,151(7):1537-1548.

[18]Raivich G,Bohatschek M,Da Costa C,et al.The AP-1 transcription factor c-Jun is required for efficient ax onal regeneration[J].Neuron,2004,43(1):57-67.

[19]王永堂,魯秀敏,曾琳,等.Nogo及其受體在脊髓損傷修復中的作用機制[J].中國康復理論與實踐,2007,13(11):1008-1010.

[20]Nishida T,Yanai R.Advances in treatment for neurotrophic keratopathy[J].Curr Opin Ophthalmol,2009,20(4):276-281.

[21]劉志雄,張伯勛.周圍神經外科學[M].北京:北京科技出版社,2004:16-17.

[22]M akwana M,Raivich G.Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration[J].FEBS J,2005,272(11):2628-2638.

[23]Nelson TJ,Sun M K,Hongpaisan J,et al.Insulin,PKC signaling pathways and synaptic remodeling during memory storage and neuronal repair[J].Eur J Pharmacol,2008,585(1):76-87.