中藥復方藥效物質基礎研究進展Δ

彭苗苗，方 蕓（1.南京中醫藥大學中西結合臨床醫學院，南京市 210008；2.南京市鼓樓醫院，南京市210008）

中藥藥效物質基礎研究是中藥現代化戰略的重中之重，其本質是尋找一種可以發揮綜合藥理作用的特殊的化學藥物整體。如今，各種新興技術的發展為中藥復方藥效物質基礎的研究提供了有力工具，如膜分離、血清藥理學、血清藥物化學、藥動學、生物膜色譜、Caco-2細胞、指紋圖譜、計算機學和高通量篩選等技術的發展以及天然組合化學庫和中藥多靶點作用機制、系統生物學、化學物質組學等理論體系的發展，使藥效物質基礎研究取得了長足進步。本文著重就有關研究方法技術及理論體系進展作一綜述。

1 研究技術和方法

1.1 體內化學成分研究方法

體內化學成分研究的方法有血清藥理學、血清藥物化學及藥動學。血清藥理學與血清藥物化學的緊密結合，有助于中藥藥動學的研究和中藥藥效物質基礎的闡明。而中藥藥動學的研究又對血清藥理學和血清藥物化學提出了更高的要求。

血清藥理學最早是由日本學者田代真一在20世紀80年代提出并應用于中藥方劑有效物質基礎研究的，其理論依據是中藥成分雖然復雜，但進入體內且被測到的化學成分數目是有限的。體內復方來源的化學成分，可以代表方劑整體藥效，其體內藥動過程和藥效存在相關性，因此可以用含有有效成分的血清進行藥效學研究，分析復方成分變化引起的效應改變。曹宜等[1]用血清藥理學的方法研究茵陳蒿湯提取物的保肝作用，提示茵陳蒿湯的保肝物質是醇溶性的，且是其中極性比較小的部分。但血清藥理學缺點在于血清中成分不清楚，還是一種“黑箱”操作，因此還需借助血清藥物化學進行研究。

中藥血清藥物化學是在全面分析中藥入血成分的基礎上，通過藥效相關性實驗確定真正的有效成分，并對有效成分的體內動態、代謝及消長規律進行研究，從而闡明整個復方的藥動學特征。竇志華等[2]對復方五仁醇膠囊進行了血清藥物化學研究，用高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法，比較復方五仁醇膠囊含藥血清色譜圖和空白血清色譜圖，分析該制劑給藥后血清中產生的藥源性成分。靜脈給藥后血清中產生的13個藥源性成分全部來自君藥五味子，這些成分可能是復方五仁醇膠囊體內直接作用物質。王喜軍等[3]對六味地黃丸進行血清藥物化學研究，口服后發現了11個入血成分，其中4個為新產生的代謝產物，7個為六味地黃丸體外所含成分的原型。

中藥血清藥物化學推動了中藥藥動學的發展。中藥藥動學主要研究中藥有效成分、單方及復方體內過程動態變化的規律，并將研究結果用數學方程和相關藥動學參數來表達。如，曾俊芬等[4]對生化湯的藥動學參數進行研究，用HPLC法測定阿魏酸的含量，得知兔口服生化湯后體內阿魏酸的分布代謝呈二室模型，其達峰時間為11.69分鐘。

1.2 生物膜色譜法

中藥提取物不經分離直接與模擬生物膜結合，能夠很好地闡明中藥多成分、多靶點協同作用的特點。由于模擬生物膜可以通過改變相關的影響因子很方便地模擬人體的生理環境，而且有較好的穩定性，因此為研究藥物在體內的吸收以及活性成分的篩選提供了一種簡便的模型。

1995年，Beigi F等[5]首次采用凝膠作為載體、利用固定化的脂質體作為固定相，模擬小腸上皮細胞對藥物的吸收過程。隨后，國內的毛希琴等[6]對這一方法進行了改進，建立以涂敷磷脂的硅膠作為模擬生物膜的固定相，用于預測藥物的小腸吸收，并且將該技術成功應用于單味中藥的研究。齊煉文等[7]將脂質體作為模擬生物膜，采用平衡透析與液相色譜聯用技術，建立了一種研究中藥成分與模擬生物膜之間相互作用的新方法。該方法可用于預測藥物在體內的吸收情況，進而研究中草藥及復方的藥效物質基礎。毛希琴等[8]采用涂敷磷脂的硅膠為模擬生物膜色譜固定相，與傳統的凝膠載體相比固定相的機械強度及磷脂固載能力均有較大提高，且有較好的穩定性，用3種緩沖條件模擬小腸吸收的緩沖環境，同時涂敷磷脂形成的脂環境能夠較好的模擬細胞膜所起的作用，使得用色譜模型預測藥物小腸吸收的準確程度有了很大提高。

1.3 Caco-2細胞技術

Caco-2細胞模型是一種在體外研究藥物分子穿越特定生物屏障進行轉運的新工具。由于具有體內腸上皮的許多形態和功能上的性質，它為研究藥物的轉運機制、預測藥物的小腸吸收情況以及藥物在腸道的代謝提供了基礎。Caco-2細胞模型被認為是目前最好的體外吸收模型，可用于快速評估新藥的細胞滲透性，闡明藥物轉運的途徑，評價提高膜通透性的方法，確定被動擴散的藥物最合適的理化性質和評估新藥的潛在毒性作用等，成為藥物吸收研究的必備手段。

經典的Caco-2細胞模型是在Transwell板上培養單層Caco-2細胞，多用于單體藥物吸收的研究。董倩倩等[9]將Caco-2細胞模型進行改良，加大細胞量，直接進行丹參成分的吸收研究，并結合液-質聯用技術，將可吸收成分的篩選和鑒定結合起來，為復雜的中藥體系活性物質體外篩選提供了一個途徑。Boyer J等[10]利用單層Caco-2細胞研究蘋果和大蔥勻漿中槲皮素苷和苷元的吸收。結果表明，經乳糖酶處理的蘋果和大蔥勻漿可以增加槲皮素的生物利用度。可見，Caco-2細胞模型為檢測黃酮葡萄糖苷從食物吸收的生物利用度提供了可靠的體外模型。

1.4 指紋圖譜技術

中藥材或中成藥經過適當處理后，利用現代信息采集技術和質量分析手段得到的能夠顯現中藥材或中成藥性質的圖像、圖形、光譜的圖譜及其數據，稱為中藥指紋圖譜[11]。對于中藥的多成分和整體作用，應該用指紋圖譜的方法來控制中藥直接提取物中的盡量多的成分。它可以較全面地反映中藥所含化學成分的種類與數量，進而反映中藥的質量和中醫用藥所體現的整體療效，為中藥復方物質基礎的研究提供科學性和合理性。現階段中藥的有效成分大多尚未明確，中藥指紋圖譜的整體性和模糊性正好符合中藥質控整體性的要求，較之單一成分或指標成分的質控方法，更具有科學性和全面性。

目前，指紋圖譜的測定多采用HPLC法。梁生旺等[12]采用HPLC法分析，獲得金銀花不同提取部位的指紋圖譜，同時選擇小鼠耳腫脹抗炎實驗測定不同提取部位的藥理活性，以線性回歸解釋化學信息和藥理活性的相關關系。結果，以甲醇提取部位的藥理活性最強，故以此部位的HPLC圖譜來制定金銀花的“藥譜”。李康等[13]在減味藿香正氣水藥效物質基礎的研究中得出色譜峰X3和X25所代表的化學成分量的增加能增強對乙酰膽堿刺激的家兔離體兔腸的抑制作用強度，確定X3和X25代表的化學成分為該藥對家兔離體兔腸抑制的藥效物質基礎。但是在中藥指紋圖譜中，可能還含有很多未知化合物，該對它們如何處理還是一個尚待解決的問題。

1.5 高通量篩選技術

高通量篩選應用多種藥物作用靶點對大量化合物進行高速、高效、低成本、微量化的篩選，最大限度地發現藥物。它將化學、基因組研究、分子生物學以及自動化儀器等先進技術有機組合成一個高程序、高自動化的新模式，從而創造了發現新藥的新程序。

藥物必須通過多種生物膜才能到達靶區，藥物的細胞內活性要求其必須通透目標細胞的生物膜才能起作用。當前，從考察藥物膜通透性來進行活性分析，是篩選組合化學庫和中藥天然成分庫的一個新亮點。朱深銀等[14]建立了黃嘌呤氧化酶活性的紫外檢測法及其抑制劑體外高通量篩選模型，通過對篩選條件優化，建立了可靠的篩選模型，并對71 760種樣品進行了初篩，發現27個活性化合物，命中率為0.038%，其中有17個有較好量-效關系。張丹參等[15]通過對建立的谷胱甘肽轉移酶（GST）抑制劑的高通量篩選模型，對不同來源的31 098個化合物樣品進行高通量篩選。通過初篩和復篩，從中發現了4個有較強抑制活性的樣品。該模型適合于大規模的高通量篩選，平均日篩選量可達15 000樣次以上，為尋找新的GST抑制劑提供了一種先進的技術手段。

2 中藥復方物質基礎研究的理論體系

2.1 天然組合化學庫和多靶點作用機制

周俊院士提出的天然組合化學庫的思想和中藥多靶點作用的機制，為我們研究復方提供了理論依據。他認為中藥復方是一個天然組合化學庫，是根據中醫理論和實踐以及單味藥的功能主治性味，通過人工組合形成的具有療效且相對安全的天然組合化學庫。這種“天然組合化學庫”具有兩個基本特點：①含有幾種或某群有效或有生物活性的化學成分；②所含的化學成分是多類型的，可能含有酚類、生物堿、萜類、甾體和配糖體等，是一個多樣化的庫。我們要做的是找到某種分離手段從中藥及其復方中獲取“天然組合化學庫”。中藥藥效物質基礎的生物活性篩選/化學在線分析方法[16]，能夠使有效成分的分離與篩選相結合，克服以往先從中藥中分離單體或有效部位，再分析其藥效，致使成分分離與效應篩選脫節的弊端，有助于闡明中藥多成分、多靶點的作用特點。

無機陶瓷膜分離技術進行藥效物質基礎研究時，依據中藥有效成分的分子量特征，對中藥及其復方進行“集群篩選”，既符合中醫藥理論的核心“整體觀念”，又與當今藥學學科前沿“天然組合化學庫”研究思路不謀而合[17]。鑒于開展這種“天然組合化學庫”所發揮的“多靶作用”研究的復雜性，由藥理模型來篩選“天然組合化學庫”必將是十分艱巨而遙遠的歷程。

2.2 系統生物學和整合化學物質組學的整體系統生物學

2.2.1 系統生物學：系統生物學是繼基因組學、蛋白質組學等組學提出之后，首次在分子生物學的知識框架下，從整體層次上研究生命系統的一門新興科學[18]。系統生物學認為生物系統具有“整體、動態、層次、整合”的特點，通過生物體內不同網絡之間的信息傳遞和整合，使基因或蛋白質產生出最終的生物學功能。它在以往分子生物學提供的大量基因、蛋白質等系統構成信息的基礎上將單個生物分子放在整體中加以研究，并以了解整體層次的功能為最終目的。

中醫藥理論的特色之一就是整體性，而且中藥在與人體作用時其活性成分與靶系統之間發揮著強大的系統與系統的作用，這種整體性思想和用藥規律與系統生物學具有相通性，會促使中醫藥學在其自身發展中借助系統生物學這門現代生物學的語言、手段和成果去闡述和進行理論創新[19]。

2.2.2 整合化學物質組學的整體系統生物學：羅國安等[20]以中醫藥學和系統生物學為基礎，建立一個整合化學物質組學的整體系統生物學體系，用于研究外部干預系統（中藥復方）與生物應答系統（人體復雜系統）之間“系統-系統”的相互作用。整合化學物質組學的整體系統生物學提供了一個中醫藥學與現代科學交流融合的平臺，有助于全面、系統、深刻的揭示中醫方劑的藥效物質基礎和作用機制，闡明中藥復方的配伍規律，指導復方新藥研發，更好地傳承和發展中醫藥理論。

3 結語

中藥復方十分復雜，使其藥效物質基礎的研究比較困難，表現在：（1）中藥復方的有效成分是一個復雜的多成分組合，即多種成分共同發揮作用；（2）中藥復方有效成分可能是中藥原藥材中不存在的物質，在復方煎制過程中通過多種成分相互作用產生，也可能是藥物進入體內后，經過體內代謝產生的；（3）有些有效成分可能是間接途徑發揮作用，在脫離機體整體后單獨成分可能不能表現出應有的作用；（4）有些成分的作用可能是我們目前尚未認識的，對這些成分，在研究中可能被忽視。因此，中藥復方物質基礎的研究要從傳統的思路和方法中走出，不斷引入新的理論、思路、方法和技術。現在很多相關學科的研究成果被應用到此領域中來，將中藥復方多成分、多靶點、多途徑的作用特點與基因、蛋白表達關聯起來進行高通量篩選。血清藥理學與血清藥物化學、藥動學、生物膜色譜、指紋圖譜、生物芯片、高通量篩選等技術整合到中藥復方的研究中，具有廣闊的發展前景。這些方法和技術的綜合運用，可能會在中藥復方效應物質基礎研究方面取得重大突破，從而對闡明與發展中醫藥理論，闡釋復方制劑化學成分變化規律產生深遠影響；并為創制現代新型中藥、提高中藥質控水平、實現中藥現代化奠定堅實基礎。

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