大鼠長期毒性試驗質量控制探討

許 迪，孔利佳，杜佐華，周順長，葉明霞，熊美云

（1.華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部，武漢 430030；2.華中科技大學同濟醫學院藥理學系，武漢 430030）

長期毒性試驗可以觀察連續反復給藥時，實驗動物出現的毒性反應、劑量與毒性效應的關系、主要毒性靶器官、毒性反應的性質和程度、毒性反應是否可逆等；還可觀察在連續反復給藥時，動物的耐受量、無毒反應劑量、毒性反應劑量及安全范圍；并可了解毒性產生時間、達峰時間、持續時間及可能反復產生毒性反應的時間，有無遲發性毒性反應、有無蓄積毒性或耐受性等［1］。這充分說明長期毒性試驗在臨床前安全性評價中的重要地位，對于新藥研究成功與否起舉足輕重的作用。

長期毒性試驗是臨床前毒性評價的主要內容，是新藥審評重點內容之一，是能否過渡到臨床試用的主要依據。另外，它為臨床安全用藥的劑量設計提供參考依據，為臨床毒副反應的監護及生理生化指標檢測提供依據。因此，必須對長期毒性試驗進行質量控制。主要包括試驗開始前的試驗設計質量控制、試驗過程中的全程質量控制和試驗結束后的資料整理和實驗報告質量控制。

1 試驗設計質量控制

試驗設計是進行試驗和統計分析的先決條件，是試驗研究獲得預期結果的重要保證。長期毒性試驗往往需要參考急性毒性、一般藥理、藥代動力學研究和短期重復給藥試驗結果等進行合理設計。試驗設計應由富有經驗的藥物毒理學家和藥理學家負責把關。

1.1 劑量設置

劑量設置科學合理是試驗成功的關鍵。劑量設計的方法有半數致死法、藥代動力學法、最大耐受量法、擬用臨床劑量法和等效劑量法等［1］。尤其是后三種方法，具有較高的參考價值，受到毒理學界的重視。不過，受試物各種各樣，不可機械地照抄照搬，而應當是個案研究，對具體藥物進行認真而細心的預試，才是摸準劑量的關鍵。正式試驗常用三個劑量組和一個陰性對照組。高劑量組應有部分動物出現毒性反應或死亡（不超過20％），目的是為尋找毒性靶器官、毒性反應癥狀及拯救措施提供依據，中劑量組應使動物產生輕微的或中等程度的毒性反應，低劑量組應略高于藥物對動物的有效劑量或臨床試驗用劑量而不出現任何觀察指標的異常，目的是為尋找動物安全劑量范圍，為臨床劑量的設計做參考。

1.2 動物選擇

SPF級封閉群Wistar或SD大鼠，5～7周齡，連續給藥6個月時宜選用5周齡的大鼠，雌雄各半。動物的預訂和SPF級動物實驗室的消毒準備工作以及用于記錄的統計表格要提前做好。

1.3 藥品給藥方式和周期

長期毒性試驗給藥途徑，要盡量模擬人類實際接觸藥物的方式或途徑，還要考慮將進行的其它毒性實驗接觸的途徑相一致。主要途徑包括灌胃（經口）給藥、注射及皮膚接觸。大鼠靜脈注射時可用腹腔注射代替，肌肉注射或皮下注射時可變換注射部位。給藥周期一般為臨床給藥周期的3～4倍［2］。3個月或3個月以上每周連續給藥6d，以維持試驗動物血漿中或體液內有較穩定的濃度水平，保持藥物的生物學效應。

1.4 觀察指標

按照《新藥審批辦法》，主要包括一般指標（體重、采食量、行為、死亡等）、血液學、血生化、臟器重量、大體解剖及毒理病理學檢查。

1.5 數據處理及結果分析

2 實驗過程質量控制

重點是嚴格遵循GLP（good laboratory practice）和SOP（standard operating procedure）要求進行試驗，確保在不同地點、不同時間使用相同品種品系動物進行同樣的動物試驗能獲得相同的實驗結果［3］。

2.1 實驗動物的質量控制

選用標準化的實驗動物，從有生產許可證單位購進健康合格動物，觀察適應一周，剔除體質過弱者和體重過大或過小者。飼養在有使用許可證單位提供的標準化實驗設施內，保障設施的正常運轉，提供實驗動物所需要的舒適環境條件和足夠的全價平衡營養，自由采食和飲水，每周更換兩次墊料，保證實驗動物的質量。對動物實驗屏障設施進行制度化、規范化、素質化管理［4］，是確保動物實驗順利進行的重要保證。

2.2 實驗動物的分組與編號

實驗動物雌雄各半，分別按體重進行分層隨機分組，隨機化方法可選用隨機數字表。每組20～30只，每籠單性別動物3～5只，每只動物均應編號，用3％苦味酸溶液標記；同時輔助以籠具編號。防止動物逃逸，確保實驗結果的準確可靠。

2.3 藥品的配制及給藥

受試藥必須符合臨床試用質量標準，保證其穩定性。藥品配制時，必須按試驗設計方法認真進行，最好現配現用。多采用不等濃度等容量給藥，給藥時間要相對固定，由熟練的技術人員進行操作，減少系統誤差。

2.4 日常觀察記錄

對實驗動物的一般狀況觀察，雖是最古老最簡單的毒性觀測方法，卻是最重要的基本觀察內容之一。體重是反映機體整個情況最靈敏的指標，攝食量的變化在大多數情況下與體重的變化是一致的，但它出現得更早，反應更靈敏。因此每天稱量動物的攝食量是非常必要的。每周稱一次體重，作為計算下周給藥量的依據。每天要認真觀察動物的神經系統、消化系統及運動系統的反應，重視對感覺器官（眼、耳等）的觀察。對于瀕死和死亡動物，要及時進行剖檢，主要臟器要取材，固定待檢；一時有困難的，也可低溫凍存，以免時間過久組織自溶。觀察記錄要及時、準確、全面、清楚，保存原始記錄，以備日后核查之用。

2.5 血液學血象、血生化指標的檢查

紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白量（Hb）、白細胞計數和分類（WBC+DC）、血小板計數（BPC）是血液學檢測的內容，天門冬氨酸氨基轉換酶（AST）、丙氨酸氨基轉換酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（T-CHO）、總膽紅素（TBIL）、空腹血糖（GLU）、尿素氮（BUN）和肌酐（Crea）是血生化檢測的內容。分別于給藥3個月（13周）、6個月（26周）和停藥后4周進行采血檢測。檢測中所需標本分別是全血和血清，采用血球自動分析儀和全自動生化分析儀進行測定。測定結果的客觀性與動物全血樣本是否凝血和血清樣本是否溶血有關。重點是改進采血方法，提倡動物麻醉后摘眼球采血和腋動脈采血法［5］，及時送檢。注意動物編號和采血管號的一一對應，做好記錄，防止出錯。

2.6 大體解剖及臟器稱重、取材、固定待檢等

首先要設計好批量動物尸檢記錄表格，包括動物種類和實驗內容、活體及解剖時間、實驗方法和分組、動物編號與病理編號、動物性別和體重、解剖所見、臟器重量、送檢單位和送檢者、解剖者和解剖日期。其次按照先對照組后實驗組的順序，采用急性失血法處死動物，做全身體表檢查，然后按先腹腔后胸腔，再腦脊髓、外周神經、骨髓、體腔外特殊部位、注射部位、皮膚和肌肉等解剖取材，防止遺漏。其中胸腺、胰腺、腎上腺、卵巢、甲狀腺、垂體、脊髓等腺體組織或微小組織應使用沙布或擦鏡紙非擠壓式包裹置于10％甲醛溶液中，防止包埋時混淆和丟失，保證病理學檢查中組織樣本數目的完整性［6］。懷疑毒性作用的靶器官要多取材，主要臟器和可疑損傷部位必須留有補做標本。取病變部位時應有足夠的正常組織連帶，有利于對比觀察。要求樣本均取自該組織的代表區。基本原則是分部位專人專責，專人稱量，專人進行組織固定。

3 資料整理及實驗報告的質量控制

長期毒性試驗是費時長、參加人員多、消耗財力和物質大、操作繁瑣復雜而又經不起重復的一個高難度研究工作，資料整理及實驗報告的質量控制尤其重要。只有將藥物作用于動物體后的臨床表現、生化、代謝和形態學觀察的結果綜合起來，才能全面、客觀、準確地評價藥物的利害及價值。應由富有經驗的藥物毒理學家和藥理學家負責把關。

3.1 數據處理和統計分析

主要包括動物體重及體重增長和食物利用率的變化、臟器重量與臟器系數、血液學血象與血生化指標等龐大的數據處理，可用excel中的數據分析功能進行分析處理。準確稱量和測定是獲得正確數據的關鍵，選擇合適的統計分析方法至關重要。對于符合正態分布的數據資料，可用t檢驗或方差分析；如果是非正態分布，則用非參數統計分析法（秩和檢驗或Ridit分析），否則結果無實際意義［7］。對于統計學上P值的意義，一定要結合臨床實際意義，才能得出客觀、可靠、可信的結論［8］。

3.2 毒理病理學檢查

病理學檢查在長期毒性試驗中占有重要地位，是評價藥物毒性的重要依據，應由富有經驗的病理學家負責。要重視器官重量指標的臨床意義，器官重量異常在大多數情況下與病理變化是一致的。病理檢查應分層次進行，先從宏觀的一般肉眼觀察，繼而用光鏡詳細檢查，必要時用電鏡觀察。病理變化最好半定量：無病理變化（一）為0分，可疑（±）為0.5分，輕度（+）為1分，中度（++）為2分，重度（+++）為3分。病理檢查最好盲法檢查，復核診斷，報告既要實事求是，如實描述，又要綜合分析，慎重結論［9］。

3.3 資料整理及實驗報告

對長期毒性試驗的資料要仔細檢查復核，結合文獻資料及有關藥物毒理學知識，實事求是地科學地分析總結。當出現毒性時，要盡可能闡明其毒性作用機理，這對最后評價有意義。撰寫實驗報告時，首頁要寫明試驗指導者，課題負責人，病理學檢查、血液生化指標測定、血液學指標測定及給藥觀察等負責人的姓名、職稱；實驗開始及結束日期、實驗承擔單位、研究室負責人和資料保存單位等。第二頁書寫試驗摘要。第三頁開始寫正文、引言、材料與方法、結果等。要用設計合理的統計圖、表清楚地顯示給受試物前、給受試物期間和停給受試物后各項檢測指標的測定值，以便了解受試物的劑量—毒性關系，統計處理應注明確切的P值大小。要客觀地描述尸檢及組織病理學檢查結果，對各種異常現象可用半定量的方式表述，以便揭示其與劑量和時間的關系。

要圓滿完成一個長期毒性試驗，除了科學合理的實驗設計外，全程的質量管理必不可少。首先要加強實驗技術人員和動物飼養管理人員的上崗培訓，提高其個人素質，增強其責任心，工作要認真負責，一絲不茍，持之以恒；其次要善待動物，不可粗暴對待或虐待動物，保障屏障系統的正常運轉［5］，滿足其維持生命、健康和舒適的需要；第三要嚴格執行GLP（good laboratory practice）和SOP（standard operating procedure），進行科學的人性化的管理，保證試驗結果的真實性、完整性、可靠性和科學性；第四要對資料和報告執行檢查復核制度，力求避免錯誤的發生，得到科學、正確的結果。

［1］呂秋軍.新藥藥理學研究方法［M］.北京：化學工業出版社，2007：382-387.

［2］周立國.藥物毒理學［M］.武漢：湖北科學技術出版社，2001：51-52.

［3］湯宏斌，孔利佳.實驗動物學［M］.武漢：湖北人民出版社，2006：255.

［4］李學勇，靳洪濤，劉欣.實驗動物屏障設施管理中的幾個關鍵問題［J］.中國比較醫學雜志，2008，18（1）：69-76.

［5］宗阿南，鄒悅，任萍萍.實驗動物質量檢測中不同采血方法的比較［J］.中國比較醫學雜志，2008，18（2）：74-75.

［6］葉明霞，孔利佳，許迪，等.藥物毒理學檢測中實驗動物組織技術探討［J］.實驗動物科學，2008，25（5）：51-52.

［7］顧祖維.現代毒理學概論［M］.北京：化學工業出版社，2005：72-75.

［8］袁伯俊，王治喬.新藥臨床前安全性評價與實踐［M］.北京：軍事醫學科學出版社，1997：61.

［9］袁伯俊，佘佳紅，陸國才.創新藥物非臨床安全性研究應注意的若干問題［J］.毒理學雜志，2007，21（4）：277-278.