小檗堿對 2型糖尿病 I CR小鼠模型的治療作用

張玲玲,黃 瀾,徐艷峰,李加美,肖 沖,劉 穎,秦 川

(中國醫學科學院實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,北京 100021)

研究報告

小檗堿對 2型糖尿病 I CR小鼠模型的治療作用

張玲玲,黃 瀾,徐艷峰,李加美,肖 沖,劉 穎,秦 川

(中國醫學科學院實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,北京 100021)

目的比較小檗堿及小檗堿與添加劑對 2型糖尿病 ICR小鼠模型的降糖、降脂效果。方法100只三周齡雄性 ICR小鼠隨機分為正常組、模型組、小檗堿組、小檗堿加低劑量添加劑組、小檗堿加高劑量添加劑組及二甲雙胍組,以高糖高脂加尿鏈佐菌素誘導小鼠 2型糖尿病模型,并分別以小檗堿、小檗堿加低劑量添加劑、小檗堿加高劑量每天灌胃干預治療 6周。檢測血糖、血清血脂、腎功指標的變化情況;給藥前后做糖耐量胰島素耐量實驗。每周量小鼠體重,動態觀察小鼠體重變化。代謝籠中測量小鼠飲食水量變化。結果模型組血糖較普食組顯著上升(P<0.01),且維持較好;血脂指標 CHO、HDL-c、LDL-c均較普食組升高 (P<0.05);其他各檢測生化指標差異不顯著。小檗堿組空腹血糖較模型組總體下降趨勢明顯且維持較好 (P<0.01);血脂較模型組有降低;糖耐量胰島素耐量較模型組有改善。二甲雙胍組血糖較模型組有下降趨勢,血脂較模型組無顯著差別。小檗堿加低劑量添加劑組較模型組血糖血脂無顯著差別。小檗堿加高劑量添加劑組血糖較模型有下降趨勢,血脂較模型組有下降趨勢,其他各項生化指標均無差別。結論小檗堿降糖效果優于二甲雙胍,小檗堿加低劑量添加劑,小檗堿加高添加劑。

小檗堿;2型糖尿病模型;

2型糖尿病是由于胰島素抵抗或胰島素分泌不足引起碳水化合物、脂肪及蛋白質代謝紊亂的綜合征。約占糖尿病人總數的 90%[1]。糖尿病是全球性嚴重的公共衛生問題,發展迅速,對人類健康危害巨大。近年來,糖尿病及其并發癥造成的醫療開支巨幅增長,并給發展中國家帶來勞動力的巨大損失。

小檗堿是從黃連、黃柏等中藥中提取的具有異喹啉生物堿類藥物的主要活性成分。歷史悠久,主要作為抗菌素使用,近年研究表明其具有治療 2型糖尿病的作用,由于其降糖降脂作用明顯,藥效不易耐受,價格低廉,受到廣泛關注。本實驗對小檗堿及添加劑降糖降脂效果做一初步觀察。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性 ICR小鼠 100只,3周齡,購于軍事醫學科學院,動物合格證號:0097206,室溫 18℃～25℃,相對濕度(30%～70%),每日光照 12 h,自由攝食引水。

1.2 飼料

常規及高糖高脂飼料均由中國醫學科學院實驗動物研究所提供,高糖高脂飼料在常用的高糖高脂飼料[2-6]配方做部分調整,成分如下:15%豬油, 15%蔗糖,3%膽固醇,1%膽酸鹽,0.6%甲基硫氧嘧啶加 66.5%常規飼料。

1.3 實驗儀器和試劑

日立 8060全自動生化分析儀,穩豪 One-Touch血糖監測儀,Linco公司的小鼠胰島素 EL ISA試劑盒。

1.4 實驗用藥物

小檗堿原料藥,批號:200506065,購自東北制藥總廠。二甲雙胍購自 Sigma公司 (D150959)。尿鏈佐菌素(STZ)購自 Sigma公司。羧甲基纖維素購自Sigma公司(C0806)。

1.5 動物模型的建立

采用高糖高脂結合尿鏈佐菌素(STZ)誘導 2型糖尿病小鼠的造模方法[5-7]。簡述如下:3周雄性I CR小鼠隨機分為普通飲食組(10只)、高糖高脂飲食對照組 (10只)、造模組 (100只,高糖高脂飲食)。喂養五周,測定小鼠空腹餐后血糖并取血、分離血清觀查小鼠葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、總膽固醇 (CHO)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、尿素氮 (BUN)、肌酐(CRE)八項血液生化指標。禁食 12 h后普通飲食組、造模組腹腔一次性注射 STZ(STZ100 mg/kg體重,用 0.1 mol/L無菌檸檬酸鈉緩沖液 pH4.5配置, 0.2μm微孔濾膜過濾滅菌)。注射 STZ后繼續高糖高脂喂養 6周。取血分離血清測定血糖等上述八項生化指標,并測糖耐量胰島素耐量。以小鼠空腹血糖≥11,胰島素耐量異常,糖耐量異常,血脂升高為 2型糖尿病模型判定標準。造模結束時共有糖尿病小鼠 65只。

1.6 分組治療

糖尿病小鼠 65只隨機平均分為模型對照組、小檗堿組 (150 mg/kg)、小檗堿加低劑量添加劑組(150 mg/kg+150 mg/kg)、小檗堿加高劑量添加劑組 (150 mg/kg+300 mg/kg)、二甲雙胍組 (250 mg/ kg)五組每天灌胃治療。小檗堿溶于 1.5%的羧甲基纖維素中。普通飲食對照組和模型組每天 0.2 mL羧甲基纖維素灌胃。灌胃 15周。

1.7 觀察指標

1.7.1 口服葡萄糖耐量實驗 (OGTT)和糖耐量曲線下面積:小鼠禁食 12 h后,給予葡萄糖 2 g/kg胃,然后在設定時間點 (0、30、60、120、180 min)眼內眥取血測血糖。STZ注射前,給藥前,給藥實驗結束時各測一次。

1.7.2 胰島素耐量實驗:小鼠禁食 4 h后給予胰島素 0.5 U I/kg,在設定時間點 (0、30、60、90、120 min)眼內齜取血測血糖,STZ注射前,給藥前,給藥實驗結束后各測一次。

1.7.3 血糖及生化指標檢測:空腹及餐后血糖采用穩豪血糖儀檢測,每兩周檢測一次。血清胰島素(F INS)用小鼠 EL ISA試劑盒檢測。血生化:采用日立 8060全自動生化分析儀檢測血清中葡萄糖(Glu)、總膽固醇 (CHO)、高密度脂蛋白 (HDL-C)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、尿素氮 (BUN)、肌酐(CRE)八項指標的變化情況。注射 STZ前、給藥前及給藥后 6周、9周、12周、15周采血觀測。

1.8 病理學

1.8.1 大體觀察:安樂動物時,詳細觀察胰腺、肝臟、脂肪組織、主動脈、腎、心臟、睪丸、坐骨神經、肌肉、淋巴組織、脾、肺、腦、腸胃,等組織的形態學變化。

1.8.2 病理切片制備:安樂動物時,取上述組織中性福爾馬林固定,石蠟包埋,常規病理組織切片處理后,H-E染色鏡檢。

1.8.3 免疫組化:安樂動物時,每只動物取固定部位胰腺中性福爾馬林固定,石蠟包埋,常規切片,組織放在涂有多聚賴氨酸的片子上封片,胰島 A細胞單克隆抗體為一抗,抗鼠 IgG為二抗,二步染色法進行免疫組織化學染色。

1.9 統計學方法

數據以均數 ±標準差表示,使用軟件 SPSS15.0對組間差異應用 t檢驗進行分析。

2 結果

2.1 高糖高脂飲食和小劑量尿鏈佐菌素對 ICR小鼠血糖血脂影響

模型組空腹血糖 >11,較普食組顯著上升 (P< 0.01)且維持較好;血脂指標 CHO,HDL-c,LDL-c均較普食組升高 (P<0.05);其他各檢測生化指標差別無統計意義 (表 1);糖耐量實驗中峰值較普食組上升 (P<0.01),峰期后延表明糖耐量異常 (圖 1);胰島素耐量實驗中谷值較普食組增高 (P<0.01),上升陡峭,表明產生胰島素耐受(圖 1)。

圖 1 造模組(高糖高脂飲食 +STZ)STZ注射 5周后葡萄糖耐量實驗(a)胰島素耐量實驗(b)Fig.1 Model group(High glucose high fat+STZ)5 weeks after STZ injection glucose tolerance (a)insulin tolerance(b)

表 1 高糖高脂飲食和 STZ注射 5周時對 ICR小鼠血清生化指標的影響Tab.1 The effect of high fat and energy diet and injection of STZ on the blood-serum biochemical indicator

2.2 治療組血糖血脂及病理改變

空腹血糖動態觀測結果顯示二甲雙胍組,小檗堿組,小檗堿加高劑量添加劑組空腹血糖較模型組均有下降趨勢,但二甲雙胍組隨時間波動較大,小檗堿組總體下降趨勢明顯且維持較好(P<0.01)(圖2);給藥 6周血清生化指標顯示,模型組較普通飲食對照組血糖上升顯著(P<0.01),血脂上升顯著(總膽固醇 (P <0.01)、高密度脂蛋白 (P <0.01)、低密度脂蛋白 (P<0.05);小檗堿組、小檗堿加高劑量添加劑組血清血糖較模型組顯著降低。小檗堿組、小檗堿加高劑量添加劑組血脂指標總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均較模型組有下降趨勢(表 2),糖耐量胰島素耐量實驗顯示小檗堿組、小檗堿加高劑量添加劑組較模型組有明顯改善(圖 3,4)。二甲雙胍組血糖較模型組有下降趨勢,其他生化指標較模型組無顯著差別(表 2)。

圖 2 給藥實驗各組小鼠空腹血糖動態觀察Fig.2 Fasting blood of administration groups

2.3 病理改變

模型組肝臟均有脂肪變性,部分出現炎細胞浸潤、血管擴張、點狀壞死;二甲雙胍治療組肝臟脂肪變性且均有點狀壞死病變;小檗堿治療組肝臟脂肪變性,部分出現炎細胞浸潤,點狀壞死;小檗堿加低劑量添加劑治療組僅部分可見脂肪變,少量炎細胞浸潤;小檗堿加高劑量添加劑治療組可見空泡變性(圖 5見彩插 6)。肝臟 HE染色結果表明對脂肪肝的改善作用小檗堿及添加劑組優于二甲組,小檗堿加低劑量添加劑組對脂肪肝有明顯改善作用效果最好,這也與生化指標中其高密度脂蛋白較模型組有顯著改善的結果一致。胰腺 A細胞免疫組化結果可見模型組胰島內間質細胞明顯增多,呈中度增生;二甲雙胍治療組間質細胞輕度增生;小檗堿治療組間質細胞輕度增生;小檗堿加低劑量添加劑治療組間質增生顯著,呈重度增生。免疫組化結果顯示小檗堿組及小檗堿加高劑量治療組明顯對受損胰腺有改善作用且優于二甲雙胍治療組,小檗堿組效果最好,這也與生化血糖檢測結果一致(圖 6見彩插 7)。

圖 3 給藥 15周各組糖耐量實驗Fig.3 Glucose tolerance after 15-week administration

圖 4 給藥 15周各組胰島素耐量實驗Fig.4 Insulin tolerance after 15-week administration

表 2 給藥 6周后各組生化指標Tab.2 The blood-serum biochemical indicator in six groups after six-week administration

3 討論

小檗堿作為抗生素使用已有悠久歷史,為毛茛科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖中提取的主要成分,屬異喹啉類生物堿。也稱黃連素,常用其鹽酸鹽。研究生人員又發現其有抗心室纖顫,防治心律失常[8];抗血小板聚集[9]的作用。其降糖降脂作用早在 1986年就有報道[10],作為中藥,由于其價格低廉,副作用小,近年來又受到中外學者的廣泛關注,其降糖作用機制研究主要集在糖脂代謝過程中的幾個通路直接降糖或通過調節脂細胞代謝間接降糖幾個方面[11,12]。本實驗中模型組血糖血脂均明顯高于對照組,高糖高脂毒性損傷肝臟胰腺,二者互為因果造成臟器損傷,糖脂代謝紊亂。治療組中,小檗堿組,小檗堿加高劑量添加劑組降糖效果明顯且對高糖及 STZ造成的受損胰腺有明顯的改善作用,且效果優于二甲雙胍組。但對高脂及其造成的肝臟病變改善并不明顯。這表明小檗堿本身具有獨立的降糖修復損傷胰腺效果。本實驗支持了小檗堿直接降糖而不是通過降脂間接降糖的作用機制。

[1] 史軼蘩.內分泌和代謝學 [M].北京:科學出版社,1999: 1304.

[2] 孫曉風,王海燕,李琳琳,等.高糖高脂飲食誘導的 2型糖尿病模型大鼠血脂特點[J].新疆醫科大學學報,2005,28(2): 104-106.

[3] 郭嘯華,劉志紅,李恒,等.高糖高脂飲食誘導的 2型糖尿病大鼠模型及其腎病特點[J].中國糖尿病雜志,2002,10(5): 290-293.

[4] 沈亞非,徐焱成.高糖高脂膳食和鏈脲佐菌素誘導 2型糖尿病模型的建立[J].實用診斷與治療雜志,2006,2O(9):649 -650.

[5] Luo J,Quan J,Tsai J,et al.Nongenetic mouse models of noninsulin-dependent diabetes mellitus[J].Metabolism,1998,47 (6):663-668.

[6] 王彤,湯秀群,趙泳誼,等.鏈脲佐菌素和高脂肪飼料誘導的實驗性 2型糖尿病小鼠模型[J].中國糖尿病雜志,2000,8 (2):111-112.

[7] 李國生,劉栩晗,朱華,等.小檗堿對 2型糖尿病中國地鼠的治療作用[J].中國比較醫學雜志,2007,10(17):559-567.

[8] 黃偉民,干以慶,任建英,等.黃連素治療室性快速心律失常[J].中華心血管雜志,1990,18(3):155-157.

[9] 儲鐘祿,姜云飛,王智慧,等.黃連素對血小板聚集和釋放的抑制作用[J].第二軍醫大學學報,1989,10(4):323-324.

[10] 陳其明,謝明智.黃連及小檗堿降血糖作用的研究[J].藥學學報,1986,21(6):401-403.

[11] Lee YS,Kim WS,Kim KH,et al.Berberine,a natural plant product,activates AMP-activated protein kinase with beneficial metabolic effects in diabetic and insulin-resistant states[J]. Diabetes,2006,8(55):2256-2264.

[12] Kim SH,Shin EJ,Kim ED,et al.Berberine activates GLUT1-mediated glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes[J].Biol Phar m Bull,2007,30(11):2120-2125.

Therapeutic Effect of Berberine Recipe on ICR M ouseM odel of Type 2 D iabetes

ZHANGLing-ling,HUANGLan,XU Yan-feng,L IJia-mei,X IAO Chong,L IU Ying,Q IN Chuan
(Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Science(CAMS) and PeckingUnionMedical College(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo compare the effectof berberine and additive on serum glucose and lipid level。MethodsType 2 diabetic modelwas induced by both high lipid food and low dose of streptozotocin(STZ)in mice.The number of 100 three month’smice were randomly divided into normal group,type 2 diabetic model group,berberine treated group, berberine and low dose additive treated group,berberine and high dose additive treated group and metfor min treated group. Every group were administered through intragastric administration of berberine,berberine and low dose additive,berberine and high dose additive in sixweeks.The capability of glucose and insulin tolerance wasmeasure.The blood glucose,the serum lipids and the function of kidneywere observed.The weight of mice was monitored every week.Food and drink of the mice were also observed in the metabolic cages。ResultsThe blood glucose level of type 2 diabetic model was obviously higher than that of normal group(P <0.01)and steady.The level of CHO,HDL-c and LDL-c in the blood lipidswere increased,other indexes were not statistical significance.The glucose level of Metformin treated group was decreased,but the blood lipid levelwas no significant difference.The glucose level and blood lipid level of berberine and low dose of additive treated group were no obvious difference.The glucose level of berberine and high dose additive treatedgroup were decreased,but the blood lipid level was no significant difference.Other biochemical indexes showed no difference。Conclusions The medical activities of berberine are better than metfor min,berberine and low dose additive, berberine and high dose additive.

Berberine;Type 2 diabetic model;ICR mouse

R-33

A

1671-7856(2010)01-0023-05

2009-09-15

張玲玲,碩士生,研究方向:2型糖尿病發病與治療機制研究。E-mail:zhangll821025@163.com

秦川,博士生導師。E-mail:qinchuan@pumc.edu.cn