系統表達 HB-EGF轉基因小鼠的建立

張 偉,馮 娟,陳 煒,張小娟,袁樹民,廉 虹,張連峰

(中國醫學科學院實驗動物研究所北京協和醫學院比較醫學中心,衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

研究報告

系統表達 HB-EGF轉基因小鼠的建立

張 偉,馮 娟,陳 煒,張小娟,袁樹民,廉 虹,張連峰

(中國醫學科學院實驗動物研究所北京協和醫學院比較醫學中心,衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室,北京 100021)

目的建立系統表達肝素結合性表皮生長因子 (HB-EGF)的轉基因動物模型,利用轉基因動物模型研究 HB-EGF與組織纖維化的關系。方法RT-PCR法克隆小鼠 HB-EGF基因,將其插入 Chickenβ-actin啟動子下游,構建 Chickenβ-actin-HB-EGF表達載體,利用顯微注射的技術把表達載體注射到受精卵的雄原核中,建立 HBEGF轉基因小鼠。利用特異引物 PCR的方法鑒定轉基因的基因型,采用Western Blot方法鑒定 HB-EGF基因在全身組織的表達。分別取 HB-EGF轉基因鼠與同窩陰性小鼠的肝、腎、肺及膀胱組織進行Massion染色。結果建立了系統表達 HB-EGF轉基因小鼠,Western Blot發現其 HB-EGF在肝、肺、腎及膀胱的表達與同窩陰性對照小鼠相比明顯增加。Massion染色結果表明轉基因鼠肝、肺、腎及膀胱組織纖維化程度明顯高于同窩陰性對照小鼠。結論成功建立了系統表達 HB-EGF轉基因小鼠,HB-EGF的過度表可顯著加重組織纖維化程度。

肝素結合性表皮生長因子;轉基因;小鼠;纖維化

1991年,Higashiyama等[1]首先在巨噬細胞樣 細胞 U-937中發現了肝素結合性表皮生長因子(HB-EGF)。HB-EGF屬表皮生長因子 (EGF)家族成員之一,在全身不同的組織中均有表達,主要存在于肺、心臟、腦以及骨骼肌中。它參與許多生理過程,如傷口愈合、眼瞼形成、胚泡的植入、腎收集管的形態建成以及癌變過程等[2-4]。HB-EGF具有強大的促有絲分裂、趨化因子、黏附分子等生物活性。2003年, Iwamoto等[5]建立了 HB-EGF基因敲除小鼠,小鼠表現出嚴重的心衰,并且伴有心室和心瓣膜擴張,影響了心肌正常的功能,這說明 HB-EGF對于心臟正常發育是十分重要的。HB-EGF活性異常會導致許多心血管病理過程,如心肌肥厚、平滑肌細胞增生以及肺性高血壓[6-8]。器官纖維化 (organ fibrosis)一直是研究醫學的熱點問題之一,最近幾年的研究表明,HB-EGF與多種組織器官纖維化過程密切相關。纖維化 (fibrosis)引起器官內纖維結締組織增多,實質細胞減少,持續進展可導致器官結構破壞和功能減退,乃至器官衰竭,嚴重影響人類健康。纖維化是多種慢性病的病理和組織學基礎。為了進一步的研究 HB-EGF在纖維化過程中的作用,我們建立了系統表達 HB-EGF基因轉基因小鼠模型,旨在研究 HB-EGF與慢性肝病、慢性腎病等慢性疾病所引起的組織病理性纖維化的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及儀器

pCAGGS-AD質粒為本實驗室保存。Trizol提取液、SuperScript.First-Strand Synthesis System for RTPCR購自 Invitrogen公司。T4 DNA ligase購自 NEB公司。Q IAquick Gel Extraction Kit購自 Q IAGEN公司。引物合成及測序由上海英俊公司完成。HBEGF(M-18)多克隆抗體、Western blotting luminal reagent為 Santa Cruz公司產品。Prestained protein marker,broad range購自 Fer mentas。辣根酶標記兔抗山羊 IgG購自中杉金橋。3～4周齡Balb/c雌性小鼠購自維通利華。顯微注射儀為 Nikon TE2000.U,倒置顯微鏡為Olympus產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 獲得目的基因:Trizol法提取 C57BL/6小鼠肺臟的總 RNA,用 SuperScript.First.Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒逆轉錄獲得肺臟總cDNA,通過高保真酶進行 PCR擴增獲得帶有 HindⅢ酶切位點的 HB-EGF cDNA,上游引物為:5′-CCAAGCTTATCCAAAGTGATCGCTGC CTC-3′;下游引物為:5′-CCAAGCTTAAGTAGCCTCTGAAGGTT CCTATAG-3′。目的條帶為 709 bp。將其與 pMD18-TVector連接送去測序,發現無突變,以 HindⅢ酶切回收該片斷。

1.2.2 轉基因注射片段的制備:用于轉基因的載體pCAGGS-AD含有全身組織表達的啟動子 chickenβactin。將載體 pCAGGS-AD用 HindⅢ酶切,去磷酸化,膠回收載體。用 T4 DNA ligase將酶切后的載體和經測序正確的目的片段連接,構建成 pCAGGSAD-HB-EGF表達載體。然后經 PvuI酶切將表達載體線性化,Sephedex-G50柱純化 DNA,通過凝膠電泳進行定量后用于顯微注射。

1.2.3 轉基因操作:用孕馬血清和人絨毛膜促性腺激素對 3、4周齡的 C57BL/6小鼠進行超排后,從輸卵管的壺腹部將受精卵取出,向受精卵雄原核中注入DNA溶液,在二氧化碳孵箱 (37℃)中培養過夜,將發育成兩細胞的卵挑選出來,移植到 ICR假孕小鼠的輸卵管中。

1.2.4 PCR法鑒定 HB-EGF轉基因小鼠的基因型:本實驗通過設計跨外顯子的特異引物,采用 PCR擴增技術,確認小鼠中是否有轉入的基因。轉基因小鼠在出生 9～14 d用剪趾法標記,收集剪下的組織,用高鹽法提取基因組DNA,利用特異引物進行 PCR檢測。在 20μL體系中加入:10 ×PCR Buffer 2 μL,25 mmol/L MgCl 1μL,10 mmol/L dNTP 0.4 μL,上游引物 (50μmol/L)0.2μL,下游引物 (50 μmol/L)0.2μL,模板 DNA 1μL,Taq DNA polymerase(5 U/μL)1μL,ddH2O 15μL。反應條件為:94℃預變 4 min,循環參數為 94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,30個循環后 72℃延伸 7 min。上游引物為5′-GTCGGTGATGCTGAAGCTC-3′;下游引物為5′-CTACAGCCACCACAGCCAAG-3′,目的條帶為491 bp。

1.2.5 Western Blot:分別提取兩個首建鼠的 Fl代陽性轉基因小鼠和同窩陰性對照小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、胰臟、小腸、骨骼肌、膀胱、睪丸、子宮組織的蛋白,進行 SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白條帶轉移到NC膜上,置于 5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉 1 h;加入1∶200稀釋的 HB-EGF(M.18)多克隆抗體,用雜交袋封住,4℃孵育過夜。倒掉一抗,用TBST洗膜 3次,每次 10 min。然后加入1∶10 000辣根過氧化酶標記兔抗山羊的二抗,置于搖床上搖動,室溫下 1 h。棄去二抗,TBST洗膜 3次,每次 5 min,TBS洗膜 1次,10 min。將膜置于化學發光劑中,曝光、顯影及定影,用 SynGene GeneTools軟件分析所得的結果。

1.2.6 Masson染色:分別取 HB-EGF轉基因鼠與同窩陰性小鼠的肝、腎、肺及膀胱組織,固定于 4%中性甲醛中,做石蠟切片,常規脫蠟至水。Masson復合染色 5 min,0.2%醋酸水溶液稍洗,5%磷鎢酸5～10 min,0.2%醋酸水溶液浸洗 2次,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察,膠原纖維為綠色。

2 結果

2.1 獲得轉基因注射片斷

得到的目的片斷與 T載體連接后送去測序,測序結果經 Blast分析顯示,709 bp的 HB-EGF cDNA與 Genebank中序列的同源性為 100%。由于線形DNA的整合效率高于環形的 DNA,將構建的環形pCAGGS-AD-HB-EGF表達載體用 PvuI酶切后,得到了線形的DNA片斷(圖 1),濃度為 3 ng/μL用于顯微注射。

圖 1 轉基因注射片斷的構建Fig.1 The construction of transgenic fragment

2.2 轉基因小鼠基因表型的鑒定

用特異引物對 HB-EGF轉基因小鼠的基因組進行 PCR擴增,結果的到兩只陽性首建鼠(圖 2)。

圖 2 HB-EGF轉基因小鼠基因表型分析Fig.2 Genotyping HB-EGF transgenic mice with PCR

2.3 HB-EGF基因的表達

用Western Blot方法檢測 HB-EGF蛋白在心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、胰臟、小腸、骨骼肌、膀胱、睪丸、卵巢、子宮組織的表達情況,結果表明,HB-EGF在心、肝、肺、腎、胃、胰臟、骨骼肌、膀胱、睪丸、卵巢、子宮組織均有表達;兩只首建鼠的 F1代陽性轉基因鼠的肝、腎、肺及膀胱組織中 HB-EGF蛋白的表達明顯高于同窩陰性對照小鼠 (圖 3)。

圖 3 Western Blotting鑒定 HB-EGF蛋白在轉基因鼠肝、腎、肺和膀胱組織的表達Fig.3 Western blotting analysis of HB-EGF expression in liver,kidney,lung,and bladder

2.4 Masson染色

光鏡下觀察,膠原纖維為綠色。結果發現陽性轉基因鼠 F1代肝、腎、肺和膀胱組織細胞間的膠原纖維明顯多于同窩陰性對照小鼠(圖 4見彩插 5)。

3 討論

近年大量研究結果表明,細胞因子通過作用于細胞表面的相應受體,在促進細胞增殖、細胞外基質(extracelluarmatrix,ECM)積聚和器官纖維化發生發展中起重要作用。參與器官纖維化常見的細胞因子有轉化生長因子-β(transfor ming growth factor-β, TGF-β)、血小板源生長因子 (platelet-derived growthfactor,PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epider mal growth factor, EGF)、白 介 素-1 (interleukin-1, IL-1)、 IL-6、 IL-8、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ-干擾素 (interfer -γ, INF-γ)和胰島素樣生長因子 (insulin-like growth factor,IGF-1)等。在生理情況下,眾多細胞因子構成的網絡處于平衡狀態,但在病理情況下,這一平衡被打破,正向調節纖維化的細胞因子增加,并發生級聯反應,而負向調節細胞因子減少,從而導致細胞外基質過度沉積而形成纖維化。

越來越多的證據證明,在多種組織和器官的纖維化過程中,HB-EGF發揮著非常重要的作用。Means等[9]對胰腺特異表達的 HB-EGF轉基因小鼠研究表明,HB-EGF轉基因小鼠胰島間質增多,隨著年齡的增長胰腺內分泌室和外分泌室均發生纖維化,并進一步誘發高血糖和胰臟導管上皮細胞增生,提示 HB-EGF引起胰島和間質的相互作用導致胰腺疾病的發生。鑒于成纖維細胞和胰島的黏附需要生長因子受體 (EGFR)活性,這一信號通路可能參與胰腺疾病的纖維化部分。Ingram等[10]研究表明, HB-EGF與腎成纖維細胞增生有關,在釩誘導的腎成纖維細胞增生中 HB-EGF表達明顯增加,且MAPK(ERK)信號通路參與這一過程。以往研究表明,在部分肝臟切除后的新生肝中,HB-EGF只在非實質細胞中表達,而不在肝細胞中表達。但 Kiso等[11]研究發現,在肝癌形成過程中,HB-EGF會在纖維變性的肝細胞中出現表達。Ushikoshi等[12]利用腺病毒轉導心肌梗死 (M I)的兔子,除發現能夠導致左心室肥厚外,還加速了細胞程序化凋亡和纖維化的水平,在M I部位出現成肌纖維細胞和巨噬細胞積聚。體外實驗顯示 HB-EGF主要表達于培養的成纖維細胞。表明 HB-EGF可能對心臟成纖維細胞的生長發揮調節作用,提示 HB-EGF很可能成為治療心肌肥厚和纖維化的治療靶點。

對本實驗所構建的系統表達 HB-EGF轉基因小鼠研究表明,隨著肝、腎、肺和膀胱組織的 HB-EGF表達升高,其纖維化程度加重,提示 HB-EGF在這些組織纖維化的過程中發揮著重要作用,而其具體分子機制有待進一步研究。

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The Establishment of HB-EGF System ic Expression in Transgen icM ice

ZHANGWei,FENG Juan,CHEN Wei,ZHANG Xiao-juan,YUAN Shu-min,L IAN Hong,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratory Animal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&Comparative Medicine Centre,PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo construct heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor(HB-EGF) transgenic mice in order to investigate the role of HB-EGF in the fibrosis of tissues.M ethod HB-EGF gene was cloned for m mouse with RT-PCR.The cloned HB-EGF gene was then inserted downstream of Chickenβ-actin promoter to construct the vector which could express HB-EGF gene in system.The transgenic mice were produced by microinjection method and the genotype was detected by PCR with specific primers.The expression profiles of HB-EGF in body tissues were illustrated by Western Blot.Massion staining of liver,lung,kidney and bladder from transgenic mice and nontransgenic control mice was carried out。ResultsTwo lines of HB-EGF transgenic mice were established.The expression levels of the HB-EGF gene in liver,lung,kidney and bladder from transgenic mice were obviously higher than those form controlmice.The extents of fibrosis in the liver,lung,kidney and bladder of transgenic mice were significantly enhanced by the expression of the transgene。ConclusionTwo lines of system-expressing HB-EGF transgenic mice were established successfully.The over-expression of HB-EGF can significantly aggravate tissues fibrosis degree.

Heparin-binding epidermal growth factor;Transgene;Mouse;Fibrosis

R349.83

A

1671-7856(2010)01-0032-04

2009-09-11

衛生部行業基金,實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

張偉(1980-),男,博士,主要研究方向:心肌病病理機制。

張連峰。E-mail:zhanglf@cnilas.org