益生菌制劑加工技術的研究概況

胡珊，胡事君，吳清平，羅華建，梁衛驅，羅詩，陳仕麗

（1.東莞市農業科學研究中心，廣東 東莞 523086；2.廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070）

益生菌制劑加工技術的研究概況

胡珊1，胡事君1，吳清平2，羅華建1，梁衛驅1，羅詩1，陳仕麗1

（1.東莞市農業科學研究中心，廣東 東莞 523086；2.廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070）

對目前益生菌制劑的加工技術，包括：噴霧干燥技術、冷凍干燥技術、包埋技術的研究概況進行了綜述。噴霧干燥技術中優化工藝參數、熱應激蛋白、細胞損傷位置和機理研究，提高益生菌制品的質量；冷凍干燥技術中保護劑、冷應激蛋白對益生菌保護作用研究；包埋技術中重點介紹了微膠囊包埋技術的包囊材料、包埋方法的研究對益生菌制劑的改良。

益生菌制品；噴霧干燥；冷凍干燥；微膠囊包埋

0 引 言

近年來，隨著經濟的高速發展，人們對身體健康的關注度日趨升高。益生菌具有包括改善消化系統功能、增強免疫、降低血脂血壓、抑制有害微生物、恢復肝功能、甚至抗惡性腫瘤等多種益生功能，其制劑倍受青睞。益生菌制劑中益生菌要能耐胃酸膽汁，活菌到達腸道并定于腸黏膜上才能對人體產生有益作用。為了保障益生菌制劑的保健作用，學者對噴霧干燥、冷凍干燥和包埋等益生菌制劑的的加工技術進行了大量研究。本文將益生菌制劑加工技術的研究概況進行歸納分析，以期為進一步研究提供參考。

1 噴霧干燥技術

噴霧干燥是食品工業應用悠久、廣泛，是成本極為廉價的一種固定化方法，方法是以單一工序將溶液、乳液、懸浮液或漿狀物加工成粉狀干燥制品。將被干燥的液體經霧化器作用，噴成非常細微的霧滴，并依靠干燥介質（熱空氣、冷空氣、煙道氣或惰性氣體）與霧滴均勻混合，進行熱交換和質交換，使得溶劑氣化或使得熔融物固化。

對噴霧干燥法造成的細胞損傷位置和機理的研究，有助于優化噴霧干燥技術在益生菌制劑生產中的應用[3]。噴霧干燥過程中細胞損傷主要由于是高溫和干燥脫水。細胞失水可能引起細胞膜、蛋白質結構和功能完整性的不可逆變化，這些基本的功能和結構對于細胞存活和保持功能性至關重要。噴霧干燥溫度對微生物的致死作用主要是由于蛋白質、核酸與酶系統等重要生物高分子的氫鍵受到破壞，導致菌體蛋白質凝固變性，核酸發生降解變性失活，從而破壞細胞的組成；熱溶解細胞膜上類脂質成分形成極小的孔，使細胞內容物泄漏，從而導致死亡。在噴霧干燥對保加利亞乳桿菌細胞膜的影響研究中發現，噴霧干燥后受損傷細胞內一些細胞質（蛋白質、核酸、鉀離子）部分流失。

近年來，噴霧干燥技術研究主要聚焦在工藝參數的優化，如適合培養基的選擇，不同保護劑的添加，不同出口溫度的存活率等。Ananta[2]等人評價了以脫脂乳為保護劑的益生菌Lactobacillus rhamnosusGG （標準株53103）噴霧干燥的可應用性。在不同出口溫度（70～100℃）條件下進行噴霧干燥，當出口溫度為80℃時，以脫脂乳為載體噴霧獲得60%的存活率。共聚焦掃描激光顯微鏡光學切面技術也揭示了奶粉可以保護噴霧過程中的益生菌。此外，以益生元（低聚果糖和聚葡萄糖）為載體代替部分脫脂乳也獲得高的存活率。陸英等[3]研究表明出風溫度越低，存活率越高，但水分含量也越大。出風溫度為70℃時，水分達到5.14%，菌體存活率在2.02%；80℃時，水分達到4.11%，存活率則下降到1.54%。考慮到貯藏性，3%以上的水分含量偏高，易帶來存活菌數快速下降的問題，因此應平衡產物水分與菌體存活率來選擇出風溫度。

在噴霧干燥技術中，應用熱休克生理調節可能增加益生菌存活率，并能增強其適應能力。陸英等[2]對酪乳桿菌（Lactobacillus caseiBD-II）的抗熱性以及不同熱激條件對抗熱性的影響進行了研究。通過實驗確定了最適熱激條件：菌齡7 h的細胞在熱激溫度50℃下處理45 min。在此條件下存活率為0.146%，較未處理細胞提高2.11倍。通過對加熱誘導不同階段的保加利亞乳桿菌的耐熱性的研究發現，細胞熱休克反應受菌齡和加熱過程的影響，加熱能誘導指數期細胞的耐熱性，然而對穩定期沒有影響。穩定期的細胞相對于指數期有更好的耐熱性，熱休克反應雖然增加了指數期細胞耐熱性，但細菌存活率還是比穩定期低。

噴霧干燥技術由于其設備簡單、成本低、易于推廣、有利于大規模連續生產等優點而在益生菌制品生產中大量應用。對益生菌耐熱性、存活率、儲存期穩定性、細胞損傷位置和機理的研究將有助于最佳的益生菌制品。

2 冷凍干燥技術

冷凍干燥技術將濕物料或溶液在較低的溫度（－10～－50 ℃）下凍結成固態，然后在真空（1.3～13 Pa）下使其中的水分不經液態直接升華成氣態，最終使物料脫水的干燥技術。物料的干燥在凍結狀態下完成，與其他干燥方法相比，物料的物理結構和分子結構變化極小，其組織結構和外觀形態被較好地保存，并具有優異的復水性，可在短時間內恢復干燥前的狀態。由于干燥過程是在很低的溫度下進行，而且基本隔絕了空氣，因此有效地抑制了熱敏性物質發生生物、化學或物理變化，并較好地保存了原料中的活性物質。因此，冷凍干燥技術是目前最好的保藏菌種方法之一，廣泛用于益生菌制劑凍干粉和益生菌保藏菌種等方面。

益生菌冷凍干燥技術凍干是冷凍和干燥技術的有機結合，細胞在凍干過程中要經受冷凍和干燥兩種激烈因素的作用，導致細胞膜物理條件或敏感蛋白結構的變化，使細胞活力下降[4]。微生物冷凍干燥期間細胞內外的水分凍結成冰，冰晶生長產生的機械力量會引起細胞機械損傷[4]。同時凍干引起溶質效應會使細胞水分溢出，具有生物活性的酶蛋白和抑制因子變性失活，細胞膜發生膜滲透性增加,使胞內的物質與胞外水溶性物質無控制地進行雙向交換,從而造成細胞的代謝損傷[5]。凍干會使細胞膜上的脂肪酸發生變化,使細胞膜的完整性會受到破壞,微生物細胞因此出現損傷[6]。

許多研究發現在乳酸菌凍干前加入適當的物質能起到保護作用，凍干保護劑如甘油、聚乙二醇、氨基酸、糖類保護劑，不僅影響乳酸菌在凍干過程中的細胞存活率，還影響保藏期間的細胞穩定性[8]。對于絕大多數細菌冷凍干燥成功的關鍵在于有效保護劑的使用，保護劑可以改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學環境，減輕或防止冷凍干燥或復水對細胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[9]。糖類保護劑如單糖、雙糖、多糖等對微生物細胞的凍干脫水具有顯著的保護作用。糖類保護劑中二糖的保護作用是近年來國內外學者研究的熱點[10]。嚴佩峰[11]研究發現嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌凍干保護劑的最優配方為：脫脂乳10%、維生素C0.5%、谷氨酸鈉0.5%、明膠1.5%。且在冷凍干燥過程中保護作用越好的凍干保護劑，其在保藏過程中的保護作用也越明顯。在所選的6種凍干保護劑中，甘油的凍干保護效果最好，其次是麥芽糊精、蔗糖、維生素C、乳糖、谷氨酸鈉。復合凍干保護劑對嗜酸乳桿菌凍干保護效果顯著，最佳凍干保護劑組合為5%甘油、2%麥芽糊精、2.5%蔗糖。

由于溫度的突然降低，微生物自身要經受一系列物理和化學變化，包括一系列蛋白的合成，稱為冷應激蛋白。冷應激蛋白的存在使菌體的耐冷能力增強，這種過程可看成是微生物在低溫條件下保護自己的一種機制。研究將乳桿菌經冷應激（10℃，5 h）處理后，菌體內出現一種分子量約6.3 ku的蛋白，而未經處理的乳桿菌不含這種蛋白，冷凍后的兩種乳桿菌的存活率分別是83%和34%。許多研究者已經證明經過冷應激處理的菌體，凍干后的存活率明顯的提高，但隨著凍干后長時間的貯存，冷應激蛋白的作用會明顯下降。李春[3]等以糞腸球菌為試驗菌株，在遲緩期、對數期中期和末期3個階段取樣進行休克處理，未處理樣為對照。結果表明：在對數期中期2 h冷休克處理的樣品產生的休克蛋白高于4、8、24樣品；10℃處理樣品休克蛋白產生量高于20℃處理樣品；對數期中期樣品休克蛋白高于遲緩期樣品。經一個月貯藏試驗，10℃處理樣品存活效果強于20℃和4℃；對數期中期取樣（10℃，8 h）休克處理效果最好。

與氣流干燥、噴霧干燥等其他干燥技術相比，真空冷凍干燥設備投資大，能源消耗及益生菌生產成本較高，因此該技術多運用于益生菌的保藏菌種和制作凍干粉。

3 包埋技術

包埋技術即給益生菌包裹在“保護衣”以抵御外界環境的侵害。益生菌的包埋技術包括以下兩種：巨包埋技術、微膠囊包埋技術。巨包埋技術一般是利用硬膠囊包裹，將益生菌填裝于空心硬質膠囊中或密封于彈性軟質膠囊中而制成的固體制劑，空心硬質膠囊殼材料（即囊材）主要是明膠、甘油、水以及其它的藥用材料。其能保護益生菌通過胃部，但是不易溶解，而且應用范圍窄，只能用在膠囊型商品上，同時不耐久存。

微膠囊包埋技術作為保護益生菌免受外界環境侵害的最有效方法，已成為國內外的研究熱點。所謂微膠囊技術就是利用天然的或者合成的高分子包囊材料，將固體的、液體的、甚至是氣體的微小囊核物質包覆形成直徑在1～5 000 μm范圍內 （通常是在5～400 μm之間)的一種具有半透性或密封囊膜的微型膠囊技術。

益生菌制劑作為功能性食品，其包囊材料除要符合食品衛生法的有關要求，做到無毒無臭，同時包囊材料的選擇對制劑產生改良作用。除傳統的高分子聚合物如海藻酸鈉、明膠、殼聚糖等[12]，利用淀粉較大的吸附能力和多孔淀粉的類似馬蜂窩的獨特中空結構將益生菌吸附包埋其中，從而起到減少細胞釋放的作用。劉萍[13]運用微孔淀粉吸附乳酸菌，以海藻酸鈉做壁材，CaCl2做固化液，用擠壓法制備乳酸菌微囊。研究結果表明通過此方法制備的微膠囊不僅具有良好的耐酸性和腸溶性而且比單一用海藻酸鈉作壁材時的活菌含量高，干燥后的微膠囊在室溫條件下存儲半個月后，每克樣品的活菌量仍然達到105基數，具備了良好的存儲穩定性。姚衛蓉[14]等研究發現多孔淀粉吸附活菌制備活菌粉，在非嚴格厭氧條件下加速儲藏，菌體的存活性能要優越于不用多孔淀粉吸附直接冷凍干燥的活菌粉的。此外，明膠甲醛、蟲膠、羧甲基纖維素鈉和苯二甲酸醋酸纖維素等腸溶性包囊材料的篩選有利于防止胃液的破壞，從而使盡可能多的菌體到達腸道。研究采用蟲膠-乙醇作為結合劑和涂膜劑制得含雙歧桿菌的腸溶性顆粒。曹永梅等[15]將雙歧桿菌粉與低聚糖及淀粉一起分散于熔化的氫化油脂中 (熔點在35℃左右)作為心材,明膠/果膠溶液作為壁材，制備腸溶性微膠囊制劑。

除了對益生菌包囊材料的研究，學者微膠囊的包埋形式進行了有益研究，研制出雙層包埋技術、多層包埋技術，以利于益生菌在腸道內更好地靶標定殖。雙層包埋技術是在乳酸菌表面包覆蛋白質，然后再包一層特殊膠體。利用這種特殊包埋技術，最外層的膠體在強酸性的胃酸中凝結，保護乳酸菌。當益生菌進入有較高pH值的十二指腸時，膠體自然分解溶化，釋放益生菌，然后第二層的蛋白質就會促進益生菌與腸壁纖毛附著，同時提供益生菌繁殖所需營養。不僅可有效延長益生菌在產品保存期的活性，也保護益生菌不受胃酸的侵蝕而安全到達小腸、大腸后定殖產生功效。William[16]等研究發現雙層包埋益生菌具有耐久存、耐酸和優越的熱穩定性。王荻[17]等發明了以海藻酸鈉、氯化鈣和殼聚糖為微膠囊包被材料，以乳酸菌或雙歧桿菌為囊芯物，利用海藻酸鈉與氯化鈣發生離子交換形成海藻酸鈣包被，再利用海藻酸鈣與殼聚糖等電點不同使殼聚糖在海藻酸鈣表面形成二次包被，低溫冷凍干燥后制成多層包被益生菌微膠囊，以達到長期保存并能在腸道定位釋放的效果。陳健凱[18]等采用雙層包埋方法，以牛奶蛋白為內層包埋劑，K-卡拉膠和刺槐豆膠為外層包埋劑，對嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌進行雙層包埋。結果表明，雙層包埋乳酸菌在上述試驗條件中比未包埋乳酸菌保持更高的存活率，顯示出用這種雙層材料包埋的乳酸菌具有穩定的生物活性，耐久存，耐胃酸，耐60℃高溫，適于在酸奶中應用。戚薇等[19]采用雙層包埋法對益生菌進行了微膠囊化。他們先以明膠、黃原膠、果膠等為復合膠體，包裹菌體形成耐酸的保護層，再用殼聚糖/海藻酸鈉符合體系通過表面交聯形成耐酸性能更好的雙層微膠囊。結果表明在使用明膠和黃原膠雙層包埋的微膠囊，常溫儲存半個月后，活菌數仍然高達2.3×1010cfu/g。

在囊化的益生菌培養過程中會遇到膠粒的穩定性問題使得細胞從膠粒中釋放出來，從而引起下批發酵時初始細胞數的下降。因此，改善膠粒穩定性的問題成為微膠囊包埋技術的關鍵。研究者在此方面做了許多研究。用陽離子聚合物進行交聯。海藻酸鈉的膠粒通過與陽離子聚合物交聯，使海藻酸鈉變得穩定。這些陽離子聚合物在膠粒周圍形成膜，用戊二醛噴灑膠粒一直被認為是減少細胞釋放的穩定技術。研究者采用4%的殼聚糖和1,6－二異氰酸酯或戊二醛交聯形成的膜，獲得了強度較大的微膠囊，這種雙功能劑和殼聚糖的反應形成了連接殼聚糖分子的橋，橋的長度取決于交聯劑的類型。用高濃度的明膠和2,4-二異氰酸甲苯交聯，去包囊乳酸乳球菌乳脂亞種取得了同樣的結果[20]。用殼聚糖、聚賴氨酸等聚合物涂膜。有報道用殼聚糖在海藻酸鈉膠粒表面裹膜，發現將海藻酸鈉膠粒懸浮在低分子量的殼聚糖溶液中形成膜后，細胞釋放可以減少40%。還發現低分子量的殼聚糖比高分子量的更易滲透到海藻膠基質中，形成更加緊密的膜。研究用聚賴氨酸對膠粒進行包膜的實驗，聚賴氨酸有較好的生物相容性，可以應用于食品工業，如酸奶的生產。但研究指出，用單層的聚賴氨酸涂膜海藻酸鈉膠粒時減少細胞釋放的作用不明顯，但用聚賴氨酸雙層涂膜時可以減少近50%的細胞釋放[21]。

4 討 論

益生菌制劑加工技術對提高益生菌制劑質量有至關重要的作用，深刻影響著益生菌制品產業化發展。各項技術的優化和技術間的聯合運用有利于改良益生菌制劑的加工技術。如將微膠囊技術與噴霧干燥、冷凍干燥技術聯合使用的研究，微膠囊化益生菌能提高對環境的適應性，對干燥和冷凍環境的耐受性，益生菌微膠囊化后進行噴霧干燥，冷凍干燥能提高活菌數；優良壁材的篩選研究，如與益生菌有更好相容性的壁材、包囊材料之間復配研究，或通過化學修飾等功能性改造，以更好創造益生菌保持活力的微環境等；包囊的益生菌作為發酵劑以優化發酵和生產液體制劑工藝等方面都值得進一步研究探索。

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Survey and outlook of the processing technology of probiotics

HU Shan1，HU Shi-jun1，WU Qing-ping2，LUO Hua-jian1LIANG Wei-qu1，LUO Shi1，CHEN Shi-li1
（1.Dongguan Agricultural Research Center,Dongguan 523086，China；2.Guangdong Institute of Microbiology,Guangzhou 510070，China）

The processing technology of probiotics is the keyword of improving the product and enhancing the health function.This paper is a survey and outlook of the processing technology of Probiotics,including spray-drying,freeze-drying,embedding.In spray-drying,it would be improved the probiotics to optimize the craft of parameters,study the heat shock protein and the cellular injuries site and mechanism.The freeze-drying focus the research on cryoprotectant and cool shock protein.The microencapsulation research include improving embedded material,double-coated technology

probiotics；spray-drying；freeze-drying；microencapsulation

Q93-33

B

1001-2230（2010）03-0047-04

2009-11-02

粵港關鍵領域重點突破項目招標東莞專項(2007168603)。

胡珊（1981-），女，碩士，從事微生物方面的研究。

梁衛驅