中藥制劑微生物限度檢查方法研究進展

陶 紅

（廣西柳州市柳鐵中心醫院藥劑科，柳州市 545007）

作為中藥制劑質量標準檢查項目內容之一的微生物限度檢查是保障藥品使用安全的重要工作，日益受到重視。微生物限度檢查系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查[1]。我國開展藥品微生物檢驗工作起步較晚，始于1972年，直到1995年版《中國藥典》才正式收載了微生物限度檢查項，2000年版《中國藥典》雖然又作了較大修訂且增收了以劑型載入的微生物限度標準，但未規定對含抑菌成分的藥品進行處理，2005年版《中國藥典》“微生物限度檢查”項下新增了微生物檢查方法學驗證[2]，這是對歷版《中國藥典》在微生物檢查法中的最主要補充。對于具有抑菌作用的中藥制劑，由于抑菌活性的干擾，用常規法檢查微生物限度的結果不能真實反映出藥品中污染微生物的情況，為此，進行藥品檢驗前必須采用適當的方法，如培養基稀釋法、薄膜過濾法、離心沉淀法或中和法消除供試液抑菌活性后，再根據《中國藥典》規定的方法進行檢查。同時，所采用檢測方法需進行驗證試驗，以確認供試品的抑菌活性和保證測定方法的可靠性，從而提高藥品本身污染微生物的檢出率。為了對規范中藥制劑的微生物限度檢查法提供科學依據，更好地控制中藥制劑的質量，本文特對近幾年已經建立微生物限度檢查法的一些中藥制劑及其驗證研究情況作如下歸納、綜述。

1 無抑菌成分的中藥制劑的檢查方法

中藥制劑中不含抑菌成分時，一般用常規法進行微生物限度的檢查。吳宗彬[3]通過采用常規法對重感靈片微生物限度檢查進行研究。結果，供試品5種試驗菌回收率試驗均達到70%以上，按照2005年版《中國藥典》微生物限度檢查法中的規定[2]：微生物限度檢查回收率試驗中，若試驗組的菌回收率均不低于70%，則照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌的菌數。由此說明重感靈片無明顯抑菌現象，可采用常規法進行細菌、霉菌和酵母菌的檢查。按照2005年版《中國藥典》微生物限度檢查法進行控制菌的檢查[2]，結果，3批菌大腸埃希菌和3批大腸菌群檢查試驗組均可檢出試驗菌，陰性組均無菌生長，陰性對照菌均無生長，說明重感靈片無明顯抑菌現象，可采用常規法進行控制菌大腸埃希菌和控制菌大腸菌群的檢查。韋紅等[4]運用常規法探討了該法對六味地黃丸微生物限度檢查的準確性和可靠性。結果，該供試品對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗菌的回收率均高于70%，故本品無抑菌作用，因此采用常規法可以進行本品的微生物限度檢查。按照2005年版《中國藥典》微生物限度檢查法進行控制菌檢查，結果，控制菌檢查陽性菌生長良好，說明本品對大腸埃希菌、大腸菌群沒有抑菌作用；陰性菌均未檢出，表明該控制菌檢查方法的專屬性好，可用于控制菌檢查。趙娟[5]通過對通脈膠囊的微生物限度檢查研究，發現采用常規方法檢查，該樣品對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的加菌回收率均高于70%，說明樣品對上述種菌均沒有抑制作用，所以可以用常規法可以進行本品的微生物限度檢查。韋紅等[6]采用常規法對黃連上清丸微生物限度檢查進行研究。結果表明，該供試品采用常規方法對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗菌的回收率均高于70%，稀釋劑對5種試驗菌的回收率均高于70%，故本品無抑菌作用，而且對控制菌檢查陽性菌生長良好，陰性菌均未檢出。因此，采用常規法可以進行本品的微生物限度檢查和控制菌檢查。

2 兼有抑菌與無抑菌成分的中藥制劑的檢查方法

一般情況下，中藥制劑所含的成分較為復雜，有的中藥制劑對有些菌沒有抑菌作用，而對另外一些菌有抑菌作用。對于前者可采用常規法進行微生物限度的檢查；后者要應用培養基稀釋法、薄膜過濾法、離心沉淀法或中和法消除供試液抑菌活性后，再根據《中國藥典》規定的方法進行微生物限度的檢查。

解翠珠等[7]通過采用常規法、薄膜過濾法和稀釋法對紫丹活血片微生物限度檢查進行研究。該供試品接種5株陽性試驗菌株，采用常規法對枯草桿菌、白色念珠菌回收率均低于70%，表明該供試品對這2種菌株有抑制作用，而對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌回收率均高于70%，說明紫丹活血片對這幾種菌無抑菌作用；而薄膜過濾法對枯草桿菌、白色念珠菌回收率均高于70%，表明薄膜過濾法對這2種菌無抑菌作用。因此，紫丹活血片微生物限度檢查標準方法為細菌數、霉菌數、酵母菌均需采用薄膜過濾法進行測定；采用常規法對控制菌大腸埃希菌進行檢查及驗證時，試驗組檢測不到試驗菌，采用稀釋法試驗組均可檢出試驗菌，陰性組均無菌生長，陰性菌對照組均無生長，可用稀釋法對控制菌檢查。汪成偉等[8]通過對桂枝茯苓膠囊微生物限度檢查的研究發現，大腸埃希桿菌、白色念珠菌及黑曲霉回收率高于70%，而金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌回收率低于70%，因此大腸埃希桿菌、白色念珠菌及黑曲霉可采用常規法；采用培養基稀釋法，可使金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的回收率高于70%，表明采用培養基稀釋法可以對桂枝茯苓膠囊中的金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的檢查。鄭麗莉等[9]通過采用常規法、薄膜過濾法和稀釋法對七葉神安片微生物限度檢查進行研究。結果，采用常規法5株菌種的回收率只有大腸埃希桿菌和白色念珠菌的大于70%，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉的回收率均低于70%，培養基稀釋法黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的回收率大于70%，培養基稀釋法和離心集菌培養基稀釋法對金黃色葡萄球菌的回收率仍低于70%，采用離心薄膜過濾法，金黃色葡萄球菌的回收率可超過70%，表明該供試品對金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用。因此，可用常規法對七葉神安片中大腸埃希桿菌和白色念珠菌的檢查，用培養基稀釋法對黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的檢查，用離心薄膜過濾法對金黃色葡萄球菌檢查。陳建啟等[10]通過對清感九味丸微生物限度檢查的研究，可以看出采用常規法對大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率不低于70%，其它菌低于70%；培養基稀釋法對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率仍低于70%，表明仍然不能消除其抑菌活性；采用離心-薄膜過濾法對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌可消除其抑菌活性，2種種菌回收率高于70%。因此，清感九味丸對革蘭氏陽性菌的代表菌株金黃色葡萄球菌和藥品中常見的污染菌株枯草芽孢桿菌抑菌作用較強，常規法和培養基稀釋法回收率都達不到70%，只有用離心-薄膜過濾各代表菌回收率才達到70%；對于控制菌采用常規法，結果試驗組檢出試驗菌，陰性菌對照組未檢出陰性對照菌，說明用常規法即可檢出大腸埃希菌、大腸菌群。

3 有抑菌成分的中藥制劑的檢查方法

中藥制劑所含的成分中有抑菌作用時，首先要選用適當的方法，如培養基稀釋法、薄膜過濾法、離心沉淀法消除供試液抑菌活性后，再根據《中國藥典》規定的方法進行檢查。

解翠珠等[11]通過采用常規法、稀釋法和薄膜過濾法對鹽酸小檗堿片微生物限度檢查進行研究，發現常規法對5株陽性試驗菌株回收率均低于70%，說明鹽酸小檗堿片不能應用常規法進行微生物的檢查；而稀釋法對黑曲霉、大腸桿菌回收率均高于70%；薄膜過濾法對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌回收率均高于70%，說明該樣品具有很強的抑菌活性，需采用薄膜過濾法消除該供試品的抑菌活性。對于控制菌，采用稀釋法可以消除供試液對大腸埃希菌的抑菌性，因此可采用稀釋法進行控制菌的檢查。張玉蘭等[12]通過對復方丹參片微生物限度檢查研究，參照2000年版《中國藥典》、《藥品微生物檢驗手冊》和2000年版《中國藥品檢驗標準操作規范》收載的微生物限度檢驗方法，運用常規法、培養基稀釋法、薄膜過濾法3種方法比較。結果表明，常規法，培養基稀釋法均不能消除藥品中抑菌物質干擾，而薄膜過濾法相對檢出率高而且能充分濾除藥品中抑菌物質，有效檢出該藥品中污染存活的細菌；該方法的陽性對照菌的平均回收率為82.11%。因此，可以用薄膜過濾法作為復方丹參片微生物限度檢查的方法。余俊等[13]通過采用2005年版《中國藥典》（一部）規定的常規法、培養基稀釋法進行菌回收率比較試驗，對銀黃顆粒、清喉利咽顆粒、柴黃顆粒3種中成藥的微生物限度檢查進行研究。結果表明，3種藥品在常規法檢測金黃色葡萄球菌回收率均低于70%。采用培養基稀釋法，金黃色葡萄球菌回收率均高于70%，說明3種中成藥在常規法檢測時均有一定的抑菌作用，不能用此法進行這3種中藥的微生物限度的檢查。采用培養基稀釋法對這3種中成藥的微生物限度檢查，菌回收率均高于70%，因此可以用培養基稀釋法作為復方丹參片微生物限度檢查的方法。豈春風[14]通過對護肝片的微生物限度檢查進行研究發現，在3次獨立的平行的試驗中，護肝片細菌計數采用常規法對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌回收率均低于70%，有顯著的抑菌作用，因此常規法不適用于護肝片細菌的檢查；采用培養基稀釋法，霉菌及酵母菌回收率均高于70%，故可用稀釋法來檢測護肝片中的霉菌及酵母菌；采用離心-薄膜過濾法則護肝片中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌回收率均高于70%，因此可用此方法來測定護肝片中的細菌數。

4 袋裝中藥煎煮液的檢查

吳紅宇[15]采用中藥抽出包裝機對其醫院自制制劑消炎利膽一號在115℃和一定壓力下進行密閉煎煮，煎煮液在常溫（20±5）℃和冷藏貯存2種情況下，以時間為單位，按照衛生部1990年版《藥品衛生檢查方法》收載的內服制劑檢查方法進行衛生學檢查。結果，煎煮液在常溫下40 d細菌總數接近限制值，低溫冷藏在80 d細菌總數接近限制值。

5 結語

上述中藥制劑的微生物限度檢查法已經建立，而對于新的中成藥或者沒有確定微生物限度檢查法的中成藥，其可能具有抑菌或抗菌作用，因此必須經過驗證試驗才能確定這些中成藥的微生物限度檢查法。采用常規法檢驗時，往往造成漏檢或檢查的結果有差異，為此進行藥品檢驗前必須采用適當的方法消除供試品中藥品成分對微生物的抗菌或抑菌作用。

由于中成藥是含有多種成分的復合制劑，具有抑菌作用的中成藥的抑菌作用的強弱可能不同，抑菌活性所采用的方法也不盡相同。因此，各藥品生產企業和研究單位應該根據中藥制劑自身的特點，在進行藥品微生物限度檢查時，選擇可行的、有效的且操作簡便、快速的方法。

隨著中藥制劑的不斷發展，其微生物限度檢查方法也在日益完善。《中國藥典》藥品微生物限度檢查是以劑型為標準，而《美國藥典》（24版）則是以品種為標準收載。由于中成藥和化學藥各有特點，其微生物限度檢查法也不能生搬硬套，全部效仿國外。所以，應盡快投入大量的人力、物力，有組織、有步驟地研究，以按照中藥自身的特點以及國外藥典中的精華部分來建立中藥制劑微生物限度檢查方法，為人民群眾安全用藥、保證中藥制劑質量提供重要的保證。

[1]耿敬軍，張 俊.藥品微生物檢查驗證試驗現狀調查與建議[J].中國藥房，2006，17（21）：1652.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005版.北京：化學工業出版社，2005：附錄68、附錄70、附錄73.

[3]吳宗彬.重感靈片微生物限度檢查及控制菌檢查方法驗證[J].河北醫學，2007，13（7）：138.

[4]韋 紅，喬志華.六味地黃丸微生物限度檢查方法學驗證研究[J].山西職工醫學院學報，2007，17（1）：1.

[5]趙 娟.通脈膠囊的微生物限度檢查方法的建立[J].創新科技導報，2008，14（2）：23

[6]韋 紅，喬志華.黃連上清丸微生物限度檢查方學驗證[J].山西中醫學院學報，2007，18（2）：48.

[7]解翠珠，李應芬.紫丹活血片微生物限度檢查方法學驗證[J].云南中醫中藥雜志，2007，18（12）：43.

[8]汪成偉，劉偉紅.桂枝茯苓膠囊微生物限度檢查方法[J].中國藥房，2009，20（21）：1657.

[9]鄭麗莉，林輝煌，吳曉玲.七葉神安片微生物限度檢查方法驗證試驗的探索[J].海峽藥學，2006，18（6）：24.

[10]陳建啟，劉炳茹，謝梅娟.清感九味丸微生物限度檢查的方法驗證[J].中國民族醫藥雜志，2008，14（1）：13.

[11]解翠珠，趙蘭青.鹽酸小檗堿片微生物限度檢查的方法驗證[J].中國民族民間醫藥，2008，6：263.

[12]張玉蘭，洪建文，羅翰宇.復方丹參片微生物限度檢查方法的建立[J].中藥材，2005，28（8）：827.

[13]余 俊，屈 慧，鄔 梅，歐陽素英.3種中成藥微生物限度檢查的方法驗證[J].中南藥學，2007，5（1）：43.

[14]豈春風.護肝片的微生物限度檢查方法的驗證[J].黑龍江醫藥，2008，21（5）：99.

[15]吳紅宇.中藥袋裝煎煮液的衛生學檢查[J].基層中藥雜志，2000，14（2）：16.