A（H1N1）疫苗免疫的血清中和抗體的交叉免疫反應分析

占玲俊，鮑琳琳，蔣 虹，叢 哲，金 光，鄧 巍，許黎黎，孫惠惠，朱 華，張連峰，秦 川

（中國醫學科學院實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021）

A（H1N1）流感病毒的基因整合來自北美和歐洲的豬體內的流感病毒基因，而這些基因之前并沒有在豬或者人體內發現（新型豬源性流感病毒），即出現了能感染人的新型豬源性A型流感病毒［1，2］。A（H1N1）流感在全球迅速發展，此次流感發病急，部分病例病程進展迅速，而臨床上有沒有特效的抗病毒藥，因此，流感的預防顯得尤為重要，其中接種疫苗是預防甲型H1N1流感流行的有效手段之一。

前期的臨床試驗證明A（H1N1）疫苗能對人群產生免疫保護作用，并且疫苗的安全性良好。但是接種甲型H1N1疫苗后，機體對病毒入侵的抵抗和保護情況到底如何，尚且需要進一步的實驗室檢測來判定。

另外，面對嚴峻的疫情，有限量的疫苗很難滿足大量人群的接種需求，現有的季節性疫苗能否對A（H1N1）產生免疫保護，面對A（H1N1）和季節性流感病毒的混合感染，人群是采用一針免疫還是兩針免疫，這些尚需進一步的探討。

流感病毒感染機體時，機體通過非特異性免疫和特異性免疫與病毒抗衡。在流感病毒的免疫防疫機制中，起保護作用的中和抗體血凝素抗體和神經氨酸酶抗體具有重要的意義，這也是病毒疫苗的研究中常常以中和抗體作為特異性指標的原因。若流感病毒抗原發生變異，機體產生的中和抗體可能由于病毒的變異而逐漸失去其保護作用［3-5］。

而檢測中和抗體的常用方法是病毒中和實驗，如果血清能中和流感病毒，則不能引起MDCK細胞發生細胞病變（CPE），反之則發生病變，由此通過判斷細胞病變間接反映血清中的抗體水平。

通過檢測血清中的中和抗體的效價可以判斷疫苗的免疫效果，另外通過觀察免疫血清與不同亞型病毒的免疫反應情況可以判斷是否存在交叉免疫，如果存在交叉免疫，則感染不同亞型流感病毒的人群可以通用某一種流感疫苗，或者混合感染不同亞型流感病毒的人群只需要接種一種疫苗，對流感病毒的防控有重要的指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料

細胞和毒株：MDCK在加入10％胎牛血清（Invitrogen）的DMEM完全培養基中傳代培養，37℃，5％CO2的培養箱中培養，48h傳代一次。A/California/7/2009 H1N1，A/Brisbane/10/2007 H3N2，A/Brisbane/59/2007 H1N1和A/Shenzhen/406H/2006 H5N1接種在10日齡的雞胚中，放37℃孵箱中生長，48h后收獲H1N1（CA7），H3N2（Brisbane）和H1N1（Brisbane）毒液，24h后收獲H5N1（SZ）毒液，毒種放-80℃儲存。擴增病毒的所有操作均在P3實驗室進行。

1.2 血清

接種2009年新型甲型H1N1疫苗的人血清30份來自本所接種過該疫苗的志愿者；陰性血清10份來自本所未接種該疫苗的正常志愿者。H1N1（CA7）和H3N2（Brisbane）陽性血清對照由本所保存。血清放-20℃保存，使用時拿出。

1.3 方法

1.3.1 血清滅活和稀釋：將陽性對照血清、10份未免疫過的血清和30份免疫血清放在56℃水浴鍋中滅活30min。之后在96孔細胞培養板中將待檢血清、H1N1（CA7）陽性血清和H3N2（Brisbane）陽性血清用維持液稀釋至1∶40和1∶400。

1.3.2 稀釋病毒：在96孔細胞培養板中將H1N1（CA7）、H3N2（Brisbane）、H1N1（Brisbane）和H5N1（SZ）稀釋為100TCID50，取50μL病毒加入到孔內。

1.3.3 中和病毒：取稀釋好的血清50μL/每孔分別與50μL的H1N1（CA7）、H3N2（Brisbane）、H1N1（Brisbane）和H5N1（SZ）等量混合，37℃孵育1.5h。將作用好的含病毒-血清混合物的微量培養板移入到生物安全柜內。同時將MDCK細胞稀釋成1.5×105/mL，其稀釋液用細胞生長液，各孔加100μL，細胞對照各孔加100μL細胞生長液和100μL細胞懸液。另外設有血清對照和病毒對照。置35℃ 5％CO2孵箱內孵育48h。經2d培養觀察CPE，同時吸取上清每孔50μL，加入1％火雞血50μL，混勻，靜置30min進行復核試驗。

2 結果

1∶40和1∶400滴度的H1N1（CA7）陽性血清與H1N1（CA7）發生中和反應后CPE結果陰性，而1∶40滴度的H3N2（Brisbane）陽性血清與H3N2（Brisbane）反應后，CPE反應陰性，但稀釋度為1∶400時CPE陽性。僅僅只有陰性血清本身不能引起CPE（表1）。

血清滴度為1∶40時，30份接種A（H1N1）疫苗的免疫血清與病毒H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）和H1N1（CA7）反應后，CPE結果陰性；而當血清滴度為1∶400時，依次有13份，20份，21份血清與病毒反應后CPE結果陰性，而相應的有11份，6份，3份血清CPE陽性，分別有6份，4份，6份血清出現CPE可疑結果。血清滴度為1∶40和1∶400時，30份免疫血清與H5N1病毒反應后，H5N1均為CPE陽性。

表1 陽性和陰性對照的CPE結果Tab.1 CPE results of positive and negative controls

未免疫過的10份對照血清稀釋度為1∶40時，與上述4種病毒反應后分別有10，10，4，0份血清CPE結果陰性，0，0，6，10份CPE陽性；1∶400稀釋時，相應的依次有8，7，0，0份CPE結果陰性，2，2，9，10份CPE陽性，與H1N1（Brisbane）和H1N1（CA7）各有1份不定陽性結果。分析表2的數據，1∶40的未免疫和免疫后血清的中和反應陽性率的相關系數0.8165，1∶400的未免疫和免疫后血清的中和反應陽性率的相關系數-0.6744（表2）。

表2 統計兩種稀釋度的免疫和未免疫血清的中和保護率Tab.2 Percentage of positive neutralization reac tion for vaccinated and unvaccinated serum

3 討論

本研究利用病毒中和實驗，將定量的病毒與不同稀釋度的血清相結合，作用后接種細胞，以測定血清中中和抗體的效價。并通過復核實驗確定CPE不是由于血清毒性引起而是病毒引起的。

稀釋度為1∶40和1∶400的未免疫和免疫血清均能與H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）發生免疫反應，但是未免疫血清不能與H1N1（CA7）發生免疫反應說明人群曾經感染過H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane），小部分人群可能感染過H1N1（CA7），但均未感染過H5N1。

分析30份免疫血清和10份未免疫的對照血清的CPE結果的相關性，根據線性方程，血清稀釋度為1∶40時，未免疫和免疫的血清中和反應陽性率的相關系數0.8165，該相關系數說明免疫后的血清與H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）和H1N1（CA7）的中和反應有增強的趨勢；血清稀釋度為1∶400時，相關系數-0.6744說明疫苗對血清中和反應有影響。綜合上述結果可以看出：1.疫苗免疫對人群的免疫力有提高；2.A（H1N1）疫苗不能提高H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）和H5N1的免疫水平，提示新型甲流疫苗不能與H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）和H5N1（SZ）產生交叉免疫。

當然，本實驗檢測的免疫血清只有30份，樣本的涵蓋面有限，而且不同地區，不同年齡的人群的免疫情況可能存在差異，所以免疫效果的評價不能完全反映疫苗對人群的保護情況，在進一步實驗中應該加大樣本量。10份未免疫血清對CA7 H1N1，H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）產生中和保護作用，甚至比免疫血清的保護率高，這可能跟未免疫血清和免疫血清的人群的地區來源，人群的年齡，病毒接觸史不同有關。另外未免疫血清和免疫血清對H5N1（SZ）均沒有中和保護作用，這也可以排除血清的非特異作用。雖然未免疫血清和免疫血清對CA7 H1N1，H3N2（Brisbane），H1N1（Brisbane）的中和保護作用不明顯，但是，隨著血清的稀釋度增加到1∶400，免疫血清的保護作用逐漸顯現出優于未免疫血清，逐漸顯現出疫苗的免疫保護作用。

本實驗血清的稀釋度設立了1∶40和1∶400，我們知道，血清抗體效價≥1∶40時，在免疫學上才有意義，而另外通過設立1∶400的稀釋度篩查人群中的中和抗體的水平，以及在此稀釋度下是否存在交叉免疫。當然，如果想全面了解人群中的抗體水平，還應該在1∶40和1∶400之間設立多個稀釋度梯度。

通過檢測未免疫血清中抗體產生情況，可以了解人群是否感染過流感病毒，檢測免疫血清的中和抗體，可以判斷A（H1N1）疫苗的免疫效果，為疫苗接種提供參考指標。另外，通過檢測血清與不同亞型流感病毒是否有交叉免疫反應，可以為多種流感病毒感染時疫苗接種提供新的線索［3，5-7］。

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