N-甲基亞硝基脲誘導小鼠胸腺淋巴瘤TCR基因重排分析

黃榕芳，余英豪，李 博

（1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科，福州 350025；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院實驗科，福州 350025）

自20世紀80年代末分子生物學技術被應用于淋巴瘤研究以來，分子生物學和分子細胞遺傳學特征已成為非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）診斷和研究中不可缺少的部分［1］。PCR是目前最常用于檢測人類T-NHL克隆性T細胞受體（T-cell receptor，TCR）重排的方法，技術上相對成熟［2，3］。采用N-甲基亞硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）腹腔分次注射的方法，本實驗室成功誘導了67.5％（27/40）實驗組小鼠產(chǎn)生胸腺淋巴瘤［4］。光學顯微鏡下胸腺結構破壞，代之以彌漫分布的中等大小的淋巴樣腫瘤細胞。免疫組織化學瘤細胞表達CD3和TdT。形態(tài)學和免疫組織化學結果證實27例胸腺腫瘤均為T淋巴母細胞淋巴瘤［5］。本部分以TCRβ和TCRγ基因重排為分子標志，應用高靈敏度的巢式PCR技術，對MNU誘導的小鼠胸腺T細胞淋巴瘤形成過程中發(fā)生的單克隆性基因重排變化進行探究性檢測，旨在組織病理和免疫分型的基礎上進一步確定MNU誘導腫瘤是否屬T細胞克隆性增生。

1 材料和方法

1.1 標本采取

選用6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠52只［SCXK（滬）2003-0003］，隨機分為實驗組40只和對照組12只。實驗組于第0、8周分次腹腔注射MNU誘導液（50mg/kg體重）；對照組腹腔注射等量生理鹽水。第22周所有小鼠頸椎脫位法處死。采集實驗組胸腺淋巴瘤組織8例和對照組胸腺組織4例，迅速放入液氮罐內，后置入-70℃冰箱凍存。

1.2 基因組DNA提取

使用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒（Takara公司），按說明書提取DNA，并用紫外分光光度儀和1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取DNA質量。

1.3 巢式PCR

1.3.1 引物設計：引物設計參照文獻［6］（表1）。

表1 PCR擴增和測序引物Tab.1 Oligonucleotide sequences for primers used in PCR assays and DNA sequence analysis

1.3.2 PCR擴增：50μL反應體系，含10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture 0.2mmol、引物各0.02μmol、模板DNA 200ng、Ex Taq酶2.5U（Takara公司）。經(jīng)30個循環(huán)，循環(huán)開始前95℃預變性4min，循環(huán)結束后72℃延伸10min，然后保持在10℃。每一循環(huán)由變性95℃/15s、退火/15s（表1）和延伸72℃/30s三相組成。第一輪以提取的基因組DNA為模板，選用外側引物；第二輪以第一輪擴增產(chǎn)物為模板，選用內側引物。每次擴增均設立無DNA模板的空白陰性對照。

1.3.3 PCR產(chǎn)物檢測：取PCR擴增產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠（含溴化乙啶）電泳，紫外透射分析儀上判讀結果。

1.3.4 結果判定標準：與標準DNA分子量（Fermentas公司）對照，出現(xiàn)1～2條清晰、不連續(xù)的電泳條帶為TCR陽性。3條以上、涂抹狀散發(fā)性條帶（smear）或無特異性條帶者為陰性。

1.4 PCR產(chǎn)物膠回收及測序

TCRγ PCR產(chǎn)物按常規(guī)在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳，用DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司），按說明書操作回收DNA，委托Invitrogen公司測定序列。

2 結果

2.1 巢式PCR擴增

8例胸腺淋巴瘤巢式PCR均顯示TCRβ、TCRγ單克隆性重排，兩步反應陽性結果均呈現(xiàn)單一特異性條帶。TCRβ基因第一輪擴增產(chǎn)物大小約為331bp，第二輪擴增基因重排帶位于190～242bp范圍內。TCRγ基因第一輪擴增帶片段大小約242～331bp，第二輪片段大小約190～242bp。對照組胸腺組織和空白陰性對照二次擴增均未出現(xiàn)特異性條帶（圖1～圖4）。

2.2 DNA序列分析

TCRγ基因內側引物的PCR產(chǎn)物片段正反向序列分析結果顯示，8例TCRγ基因的PCR陽性標本（產(chǎn)物1至產(chǎn)物8）分別為199～207bp不等的尖銳單峰。8例均含TCRGV3S1/TCRGJ1基因連接區(qū)、TCRGV3S1及TCRGJ1序列。表2所示為PCR產(chǎn)物1至產(chǎn)物8的TCRGV3S1/TCRGJ1基因重排區(qū)域片段與TCRγ胚系基因序列比對結果，其中V、J連接區(qū)插入核苷酸序列0～7bp大小。

圖1 TCRβ基因重排第一輪擴增結果Fig.1 The primary PCR reaction of TCRβ gene rearrangement

圖2 TCRβ基因重排第二輪擴增結果Fig.2 The secondary PCR reaction of TCRβ gene rearrangement

3 討論

2008年WHO造血與淋巴組織腫瘤分類的診斷標準強調，淋巴組織腫瘤應結合形態(tài)學、免疫表型、遺傳學以及臨床特點等信息界定每一種疾病實體［8，9］。目前，分子生物學技術已在 NHL的診斷應用上受到較為廣泛的重視，為NHL的傳統(tǒng)診斷方法（組織形態(tài)觀察、免疫組織化學）提供了新的技術手段輔助診斷，是對傳統(tǒng)診斷方法的重要補充。

圖3 TCRγ基因重排第一輪擴增結果Fig.3 The primary PCR reaction of TCRγ gene rearrangement

圖4 TCRγ基因重排第二輪擴增結果Fig.4 The secondary PCR reaction of TCRγ gene rearrangement

PCR技術是一種體外酶促合成特異性DNA片段的方法，其分析T-NHL基因重排的原理基于所用引物特異性結合TCR基因的V區(qū)和J區(qū)。TCR由分隔在胚系基因組染色體上的多個基因編碼，只有當基因發(fā)生重排使分隔的V區(qū)與J區(qū)靠近時，才能得到有效擴增。正常生理狀態(tài)下，胸腺組織T淋巴細胞發(fā)育過程中，TCR基因結構不斷發(fā)生隨機重排，而且V-（D）-J結合區(qū)域隨機插入不同數(shù)量的堿基形成完整的基因，故使每個T淋巴細胞均具有特異的結構基因，呈多克隆性。其PCR擴增產(chǎn)物片段長短不一，基因序列不同，電泳后表現(xiàn)為染色均勻的彌漫帶（smear）或彌漫片狀多克隆背景上相對較強的單克隆條帶。胸腺T細胞淋巴瘤則為T淋巴細胞某個分化階段發(fā)生突變的惡性克隆性增殖所致，瘤細胞為同一基因結構，屬于單克隆性。經(jīng)PCR擴增后，電泳呈一窄帶。這就是PCR檢測TCR基因重排的分子生物學基礎。本研究對Lista等［6］的研究方法作了相應改進，選用單純的巢式PCR擴增和電泳技術鑒定小鼠淋巴瘤的克隆性質。實驗過程采用兩組不同的V區(qū)引物和J區(qū)引物進行兩步反應，一方面提高了靈敏度和檢出率，另一方面也增加了反應的特異性。

表2 TCRγ基因重排V-J結合區(qū)DNA序列Tab.2 DNA sequence of TCRγ rearrangement VJ junctions

用PCR方法分析淋巴增生性疾病的TCR基因重排的研究，以前主要集中在TCRβ基因的V、D、J片段上。由于小鼠TCRβ鏈（6號染色體）V區(qū)片段眾多，有20個基因片段［10］，通用引物可能降低檢測的陽性率，家族特異性引物因引物數(shù)量太多而操作復雜。本研究引用的TCRBV5S1/TCRBJ2引物僅覆蓋1個V區(qū)基因片段，可能僅能識別胸腺組織的小部分TCRBVJ重排［6］。然而，位于13號染色體上的TCRγ基因重排發(fā)生在T細胞分化的早期，參與重排的片段數(shù)量相對有限，僅含有7個V區(qū)、4個J區(qū)和4個C區(qū)基因片段［11］，其引物可能擴增出TCRγ基因所有V-J重排。另據(jù)報道，人類基因水平的TCRγ V-J基因重排出現(xiàn)在幾乎所有的T細胞淋巴瘤及T淋巴細胞中［12］。基于以上考慮，我們聯(lián)合選用針對TCRβ和TCRγ的巢式引物，以增強特異性，提高檢出率。

本實驗使用的模板DNA來自實驗動物體內的原發(fā)性腫瘤，而非經(jīng)過培養(yǎng)的細胞系，故能真實反映淋巴瘤在體內的惡性轉化過程。研究結果顯示，在確診的8例胸腺淋巴瘤中全部檢出TCRβ和TCRγ克隆性基因重排，陽性率均為100％。二者第二輪擴增帶片段大小近似，均位于190～242bp范圍內。4例對照組胸腺組織DNA中無一例出現(xiàn)陽性條帶。不同處理組檢出陽性率差異有顯著意義，說明TCRβ和TCRγ基因重排在小鼠胸腺T細胞淋巴瘤中具有很高的發(fā)生頻率，對其克隆性和細胞源性的確定有重要價值。實驗中未出現(xiàn)假陽性或假陰性結果，分析主要原因是巢式PCR方法的高度特異性；另一方面加樣量、PCR反應條件、電泳條件等各項實驗條件的優(yōu)化，也可能有效避免了假陽性或假陰性結果的出現(xiàn)。

送檢的8例TCRγ重排PCR產(chǎn)物均得到了測序結果。將測序結果與TCRγ胚系基因［6，7］作比較，分別得出TCRGV3S1/TCRGJ1基因連接區(qū)、TCRGV3S1及TCRGJ1序列，驗證了擴增產(chǎn)物即為TCRγ基因V區(qū)與J區(qū)的克隆性重排片段。8例基因重排連接區(qū)為0～7bp大小不等片段。片段大小的差異，考慮與每一例13號染色體上V區(qū)和J區(qū)的斷裂點不同和所插入的N-區(qū)域核苷酸序列的多少有關［13］，這同時也解釋了8例DNA序列并不完全相同的原因。雖然我們未對第一輪擴增產(chǎn)物作DNA序列測定，但第二輪反應產(chǎn)物片段（190～242bp）略小于第一輪（242～331bp）符合理論推算，也間接說明了結果的可靠性。

本研究有力說明了所使用的TCRβ、TCRγ基因巢式引物對胸腺T細胞淋巴瘤的克隆性和細胞源性的確定是相當敏感而特異的，結合形態(tài)學和免疫組織化學結果［5］，再次證實MNU誘導的小鼠胸腺淋巴瘤的形成過程實際上是單個T淋巴細胞TCR基因重排后，在MNU的作用下發(fā)生惡性轉化，并單克隆性增生，最終取代胸腺內正常細胞，是屬于T細胞來源的腫瘤。

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