中藥銀杏葉對老年癡呆癥小鼠學習記憶能力的影響

謝超敏，鄭桂蘭，鐘志勇，饒子亮，鄺少松，王 剛，嚴家榮，陳系古

（廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248）

老年癡呆癥又稱阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是主要發生在老年期的一種大腦神經細胞退行性變腦病，表現為持續性高級神經功能活動障礙，即在沒有意識障礙的狀態下，記憶、思維、分析判斷、視空間辨認、情緒等方面的障礙。有資料表明，5％～15％的老年人有不同程度的癡呆癥狀。隨著我國逐步進入老齡社會，老齡化趨勢將使老年性癡呆患者數量增多，發病率逐年增高。由于AD的隱匿性和不可逆性，給家庭和社會帶來很大負擔。目前AD尚未有理想的治療方法，而隨著中醫藥的深入研究，也許能從中國的醫藥寶庫中挖掘新的治療方案，本實驗在制作AD模型小鼠的基礎上，比較中藥銀杏葉與西藥腦復康片對動物模型記憶能力恢復的影響作用，現將相關指標分析如下。

1 材料和方法

1.1 動物來源

80只SPF級KM小鼠，18～22g，雌雄各半，由廣東省醫學實驗動物中心提供［SYXK（粵）2008-0002］。

1.2 飼養環境

屏障系統。溫度20℃～25℃，相對濕度40％～70％，光照周期為12h∶12h，換氣次數（15～20）次/h。所用飲水、墊料均經121℃，30min高壓蒸汽滅菌，全價顆粒飼料經121℃，30min高壓蒸汽滅菌，飲用水為凈化水，均由廣東省醫學實驗動物中心提供。水和飼料自由飲食。

1.3 主要實驗儀器及試劑

1.3.1 主要實驗儀器：YP3001N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。熒光成像系統顯微鏡（奧林巴斯，型號：BX41）。紫外-可見分光光度計（上海尤尼柯公司產品，型號：UV-2800）。跳臺儀（山東省醫學科學院設備站，型號：YLS-3T）。

1.3.2 藥物及主要試劑：銀杏葉片，浙江某制藥股份有限公司，批號：070801。吡拉西坦片（腦復康），廣東某藥業有限公司，批號：060903。D-半乳糖：廣州威佳科技有限公司分裝。三氯化鋁：天津市福晨化學試劑廠，批號：20071102。乙酰膽堿酯酶、過氧化脂質（MDA）、超氧化岐化酶（SOD）、Na+、K+-ATPase、游離鈣離子，南京建成生物工程研究所，批號：20090108。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及實驗設計：將80只SPF級KM小鼠根據體重隨機分為4組：對照組、模型組、腦復康組、銀杏葉組，每組20只。除對照組腹腔注射等量的生理鹽水和灌胃等量的雙蒸水外，其余各組腹腔注射D-半乳糖60mg/（kg·d）（生理鹽水配制）和灌胃AlCl35mg/（kg·d）（雙蒸水配置），每天1次，連續60d。腦復康組和銀杏葉組自造模起上午給予AlCl3和D-半乳糖外，每日下午給予相應的藥物，每日1次，連續60d，灌胃體積是0.2mL/10g。

1.4.2 指標測定

1.4.2.1 小鼠跳臺試驗：學習記憶獲得性障礙實驗：末次給藥1h后開始訓練。將動物放入反應箱內（臺上、臺下）適應環境3min，然后將動物放置反應箱內的銅柵上，立即通以36V的交流電。動物受到電擊，其正常反應是跳回平臺上。訓練一次后，將動物放在反應箱內的平臺上，記錄5min內各鼠跳下平臺的錯誤次數和第一次跳下平臺的潛伏期，以此作為學習成績。小鼠鞏固記憶障礙實驗：24h后進行重測驗，將小鼠放在平臺上，記錄各鼠第一次跳下平臺的潛伏期、各鼠3min內電擊次數何受電擊的動物數總數，同時計算出現錯誤反應的動物的百分率（受電擊的動物數占該組動物總數的百分率）。小鼠記憶再現障礙實驗：停止訓練5d后（包括第5天）可以在不同的時間進行一次或多次記憶消退實驗。

1.4.2.2 腦內自由基代謝指標的測定：處死動物，取大腦，保存在冰凍下，用生理鹽水洗去血液備用，并用濾紙吸干水分，在冰浴下用勻漿器勻漿，用生理鹽水稀釋稱10％勻漿，離心（3500r/min）10min，取上清液測定腦中乙酰膽堿酯酶活性、過氧化脂質（MDA）含量、超氧化岐化酶（SOD）活性、Na+、K+-ATPase、游離鈣離子含量。乙酰膽堿酯酶活性、過氧化脂質（MDA）含量、超氧化岐化酶（SOD）活性、Na+、K+-ATPase按試劑盒說明進行操作。游離鈣離子含量，參照文獻［1］所用方法進行測定。

1.4.2.3 腦神經元細胞計數：各組小鼠取腦組織，分離海馬組織和大腦皮質，固定于10％甲醛磷酸緩沖液中，常規石蠟切片，切片厚度為5μm，進行蘇木素-伊紅（HE）染色。光鏡下進行形態學檢測，各切片觀察5個視野，并進行海馬錐體細胞、大腦皮質神經元細胞計數。

1.5 統計方法

實驗所得數據采用SPSS11.0統計軟件進行t檢驗分析。

2 結果

2.1 銀杏葉對AD模型小鼠學習記憶獲得性障礙、鞏固記憶障礙、記憶再現障礙的影響

結果表明，在AD模型小鼠學習記憶獲得性障礙、鞏固記憶障礙、記憶再現障礙跳臺實驗中，與模型組比較，銀杏葉能延長潛伏期（P＜0.05），減少小鼠錯誤次數（P＜0.05），與腦復康組比較則無明顯差異（P＞0.05），提示銀杏葉具有改善AD模型小鼠學習記憶能力的作用（表1）。

2.2 銀杏葉對AD模型小鼠腦組織SOD活性、MDA含量、游離鈣離子含量、乙酰膽堿酯酶活性及Na+、K+-ATPase的影響

結果顯示，模型組小鼠腦組織中SOD活性下降，MDA升高，表明自由基增多，抗氧化作用減弱。銀杏葉組小鼠腦組織中：SOD活性與模型組比較明顯升高（P＜0.05）、與腦復康組比較無明顯差異（P＞0.05），MDA含量與模型組小鼠比較顯著性降低（P＜0.05）、與腦復康組比較無明顯差異（P＞0.05），表明銀杏葉有升高小鼠癡呆的抗氧化能力，降低氧自由基對機體的損害。銀杏葉組小鼠腦組織中Ca2+的濃度與模型組比較明顯降低（P＜0.01）、與腦復康組比較無明顯差異（P＞0.05）；銀杏葉組小鼠腦組織中乙酰膽堿酯酶活性與模型組比較，顯著性降低（P＜0.01）、與腦復康組比較無明顯差異（P＞0.05）。銀杏葉組小鼠腦組織中Na+、K+-ATPase與模型組小鼠比較無明顯差異（P＞0.05）、與腦復康組小鼠比較也無明顯差異（P＞0.05）。數據表明銀杏葉能保護腦缺氧損害，改善記憶功能（表2）。

2.3 銀杏葉對AD模型小鼠大腦海馬錐體細胞和大腦皮質神經元細胞計數結果

結果顯示，銀杏葉組小鼠大腦海馬錐體細胞總數與模型組比較顯著性升高（P＜0.01），與腦復康組比較無明顯差異（P＞0.05）；銀杏葉組小鼠大腦皮質神經元細胞總數與模型組小鼠和腦復康組小鼠比較均無明顯差異（P＞0.05）（表3）。

表1 銀杏葉對AD模型小鼠學習記憶獲得性障礙、鞏固記憶障礙、記憶再現障礙的影響（±s）Tab.1 Ginkgo biloba on learning and memory in Alzheimer’s disease mice acquired disorder，consolidating memory impairment，memory impairment reproduction（±s）

表1 銀杏葉對AD模型小鼠學習記憶獲得性障礙、鞏固記憶障礙、記憶再現障礙的影響（±s）Tab.1 Ginkgo biloba on learning and memory in Alzheimer’s disease mice acquired disorder，consolidating memory impairment，memory impairment reproduction（±s）

注：與模型組比較，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；與腦復康組比較，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01。Note：Compared with model group，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；Compared with piracetam group，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01.

組別Group劑量（g/kg）Dose學習記憶獲得性障礙Access to learning and memory disorders鞏固記憶障礙The consolidation of memory impairment記憶再現障礙Memory representation disorder潛伏期（s）Latency 5min錯誤次數The number of errors in 5min潛伏期（s）Latency 5min錯誤次數The number of errors in 5min潛伏期（s）Latency 5min錯誤次數The number of errors in 5min對照組Control group —288±29 0.2±0.4 266±56 0.3±0.5 260±91 0.4±0.7模型組Model group — 147±135 1.9±1.7 123±125 1.9±1.8 150±101 2.1±1.7腦復康組Piracetam group 0.364 262±63* 0.3±0.5* 287±28** 0.2±0.4* 254±67* 0.4±0.5**銀杏葉組Ginkgo biloba group 0.400 268±60* 0.4±0.7* 292±15** 0.3±0.5* 242±93* 0.4±0.7**

表2 銀杏葉對AD模型小鼠腦組織SOD活性、MDA含量、游離鈣離子含量、乙酰膽堿酯酶活性及Na+、K+-ATPase的影響（±s）Tab.2 Ginkgo biloba on the Alzheimer’s disease mice brain tissue SOD activity，MDA content，free calcium ion content，acetylcholinesterase activity and Na+，K+-ATPase of（±s）

表2 銀杏葉對AD模型小鼠腦組織SOD活性、MDA含量、游離鈣離子含量、乙酰膽堿酯酶活性及Na+、K+-ATPase的影響（±s）Tab.2 Ginkgo biloba on the Alzheimer’s disease mice brain tissue SOD activity，MDA content，free calcium ion content，acetylcholinesterase activity and Na+，K+-ATPase of（±s）

注：與模型組比較，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；與腦復康組比較，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01。Note：Compared with model group，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；Compared with piracetam group，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01.

組別Group劑量（g/kg）Dose SOD（U/mg）MDA（nmol/mg）Ca2+（nmol/g）T-chE（U/mg）Na+、K+-ATPase（μmolpi/mgprot·h）對照組Control group — 163.9±28.3 2.51±0.53 86.7±15.5 1.90±0.29 4.67±0.41模型組Model group — 99.2±22.3 2.98±0.98 118.0±26.4 2.43±0.20 4.37±0.51腦復康組Piracetam group 0.364 135.0±24.8* 2.51±0.31 60.7±5.6** 1.58±0.28** 4.65±0.76銀杏葉組Ginkgo biloba group 0.400 133.7±20.6* 2.13±0.41* 61.2±10.7** 1.69±0.35**4.29±0.68

表3 銀杏葉對AD模型小鼠大腦海馬錐體細胞和大腦皮質神經元細胞計數結果（±s）Tab.3 Ginkgo biloba on the Alzheimer’s disease mice brain hippocampal pyramidal cells and neurons in the cerebral cortex cell count results（±s）

表3 銀杏葉對AD模型小鼠大腦海馬錐體細胞和大腦皮質神經元細胞計數結果（±s）Tab.3 Ginkgo biloba on the Alzheimer’s disease mice brain hippocampal pyramidal cells and neurons in the cerebral cortex cell count results（±s）

注：與模型組比較，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；與腦復康組比較，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01。Note：Compared with model group，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；Compared with piracetam group，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01.

組別Group劑量（g/kg）Dose 5個視野海馬錐體細胞總數5 view the total number of hippocampal pyramidal cells 5個視野大腦皮質神經元細胞總數5 view the total number of cerebral cortical neurons對照組Control group —140.1±14.9 116.4±22.5模型組Model group — 113.0±14.3 116.6±14.2腦復康組Piracetam group 0.364 134.3±19.2* 122.7±14.9銀杏葉組Ginkgo biloba group 0.400 143.2±24.1**126.4±12.2

3 討論

銀杏葉［2］的主要成分為醇與水提取物，兩者均能明顯改善腦神經損害。銀杏葉提取物能提高腦膽堿能神經功能，增加腦血流量，提高缺血腦組織對葡萄糖的攝取量和代謝率；減少腦組織耗氧量，具有保護腦神經細胞膜以及抗血栓、抗氧化、抗過敏、提高免疫力等功能。其片劑具有很強的清除自由基和抗氧化作用，治療腦供血不足引起的眩暈、頭痛、記憶減遲、智力下降等癥狀。據現代臨床研究，銀杏葉對以陰性癥狀為主（如社會退縮，懶散，思維貧乏，呆滯等）的慢性精神分裂癥有顯著效果，對老年癡呆癥也有一定的效果。本實驗研究中藥銀杏葉對老年癡呆癥小鼠學習記憶能力的影響，并與療效顯著的西藥腦復康片進行比較，對實驗小鼠行為學以及腦組織多項相關指標進行測定及探討。

記憶障礙動物模型是評價藥物的重要工具。本實驗通過實驗動物腹腔注射D-半乳糖（加速動物衰老程度）和灌胃AlCl3（進行鋁中毒）造模，迅速有效制作出AD模型小鼠［3］。根據跳臺實驗中的相關數據顯示，銀杏葉能延長AD小鼠潛伏期和減少錯誤次數，表明中藥銀杏葉有一定改善記憶功能作用。

衰老的過程中，AD患者腦細胞產生的神經遞質有缺損，而中樞神經系統的損傷則與腦組織物質和能量代謝異常所導致的大量自由基有關。過量的自由基可使生物膜脂質雙層中的不飽和脂肪酸過氧化，從而形成脂質過氧化產物。過氧化脂質的代謝產物MDA進一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質交聯，生成無活性的脂褐質，沉積于組織細胞，使DNA、RNA持續降低，破壞細胞膜結構，最后導致細胞無法維持正常代謝而死亡。而SOD能不斷地清除多余的自由基，保證機體代謝平衡，進而維持機體功能正常。目前，人們還普遍認為單胺類神經遞質與記憶功能密切相關，且與膽堿能神經系統交互作用。實驗結果中銀杏葉能升高老年癡呆癥小鼠腦組織中SOD的活性，有效降低MDA的含量，促進乙酰膽堿的釋放，增加腦內膽堿受體的密度，有效清楚腦內氧自由基，從而改善記憶功能，對腦組織內自由基代謝療效顯著［4，5］。

AD患者大腦的重要改變表現為腦普遍萎縮，以與高有序認識能力相關區域如海馬及相應皮質部尤明顯，腦室擴大，腦溝變寬，中樞神經區域神經元和神經突觸明顯減少或消失。神經節細胞廣泛變性，出現收縮、空泡變性與脂質沉著。近年研究表明［6］，各種原因造成的細胞超載，鈣穩態失衡，是造成細胞死亡最后的總通路。從實驗腦細胞神經元計數結果表明，銀杏葉能改善腦損傷程度，保護海馬，從而促進學習和記憶，改善AD一些癥狀。

腦復康［7］為氨酪酸的同類物，具有激活、保護和修復腦細胞的作用，可加速大腦半球間經過胼胝體的信息傳遞速度，提高學習記憶及思維活動的能力。其不良反應表現為口干、惡心、嘔吐、腹部不適、納差；中樞神經系統興奮、易激動、頭暈、頭痛和失眠等。經本實驗驗證了其對AD的顯著治療作用，而且與西藥腦復康比較，療效［8］相似，毒副作用少。

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