紫杉醇對食蟹猴和人CYP1A2、CYP3A4及CYP2A6酶代謝的影響

耿祥飛，張廣州，任 娟，王立娜，賈麗娟，沈國林，劉鴻君

（1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021；2.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071；3.中國人民解放軍第二炮兵總醫院，北京 100088；4.北京匯智泰康醫藥技術有限公司，北京 101111）

藥物相互作用是兩種或兩種以上藥物聯合使用時有時可能會對療效產生一定的影響，也可能產生不良反應。隨著中藥在世界范圍內的應用，中藥與西藥聯合應用的情況越來越多。然而人們對中藥與西藥聯合應用的后果了解很少，這在一定程度上增加了中藥與西藥聯合用藥的風險。細胞色素CYP450酶在藥物代謝中起著重要的作用，是產生藥物相互作用最重要的途徑之一。CYP1A2酶在肝組織中有特異性表達［1］，是重要的細胞CYP450酶之一，約占肝臟總的CYP450氧化酶含量的13％，而且CYP1A2酶參與許多前致癌物和前毒物的代謝活化，從而誘發基因突變或抑制一些基因的表達，造成細胞損害或誘導凋亡，甚至發生腫瘤。CYP2A6是CYP2A亞家族重要成員之一，約占整個CYP450酶系統的5％，對很多藥物和環境中化合物的清除起重要作用，參與許多藥物代謝，還可激活許多結構上非相關的前致癌物［2］，比如它能將許多致癌原如黃曲酶毒素B1、煙草中大量的亞硝胺致癌原激活為強致癌物，N-亞硝基二甲胺激活為強致癌物則與肺癌罹患率顯著相關［3，4］。CYP3A酶是其中最重要的，其含量占人肝CYP的30％［5］，參與了臨床上約50％藥物的代謝［6］，對CYP3A活性的影響將導致臨床上出現嚴重的藥物相互作用［7］。非那西汀、香豆素和睪丸酮是特異性的CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4酶的底物，通過建立相應的HPLC檢測方法，可以準確測定三種底物相應代謝產物的產量，為研究紫杉醇對CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶活性的影響提供一定的基礎。

食蟹猴在形態學、生殖生理特性和生化代謝方面與人類非常相似，在遺傳物質上也與人類有98％左右的同源性，因此，應用食蟹猴進行研究的結果最容易推廣于人類，早已被作為醫學和生物學各領域研究的理想實驗動物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：6-磷酸葡萄糖（Sigma公司）、氧化型輔酶Ⅱ（北京縱橫洋洲公司），6β羥基睪丸酮（Sigma公司），6-磷酸葡萄糖脫氫酶（北京縱橫洋洲公司），睪丸酮，非那西丁，香豆素（Sigma公司），甲醇、乙腈（色譜純）均購自天津四友試劑公司，高純水，肝微粒體（匯智泰康公司）。

1.1.2 儀器：Agilent高效液相色譜、Sigma高速離心機（Sigma公司）、MDF-U50V超低溫冰箱（-80℃）、超凈工作臺、全自動高壓鍋（日本三洋公司）、微型旋渦混合儀QL-901（江蘇海門市麒麟醫用儀器廠）、電熱恒溫水浴箱BHW-2（北京醫療設備廠）、移液槍、量筒、燒杯、SHZШ型水循環真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、抽濾器（北京八方公司）。

1.1.3 實驗動物：來自軍事醫學科學院實驗動物中心人工飼養的食蟹猴［SCXK-（軍）2007-004］，常規飼養觀察無異常表現，心、肝、腎等重要器官血液生化指標檢測正常。

1.2 方法

1.2.1 肝微粒體混合酶系配制：肝微粒體0.5mg/mL，3.3mmol/L MgCl2，3.3mmol/L 6-磷酸葡萄糖，1.3mmol/L氧化型輔酶Ⅱ，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（0.4μ/mL），0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH=7.4）定容到250mL，混合酶系配制均在冰浴上進行。

1.2.2 供試品配制：精密稱取紫杉醇341.6mg，用10mL乙睛超聲溶解，加入到孵育系統的終濃度為400μmol/L，配制成7個濃度400μmol/L、200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L。

1.2.3 睪丸酮、非那西丁和香豆素體外代謝方法：體外代謝的孵育體系按照（1.2.1）配制，每管0.25mL孵育體系中加入200μmol/L底物2.5μL，同時加入不同濃度的紫杉醇，在對照組中加入溶媒以消除實驗誤差，加完之后輕微混勻，每水平平行3個管，將反應管放入37℃恒溫水浴中孵育。

1.2.4 樣品處理方法：將反應管放入37℃恒溫水浴中孵育30min后，取出加入0.25mL冰冷乙腈終止反應，放入4℃冰箱保存1h使蛋白沉淀，3000r/min離心10min，然后加入到內襯管中10000r/min離心5min，10μL進樣于HPLC中進行測定。

1.2.5 代謝產物的檢測：色譜條件，撲熱息痛：色譜柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京匯德易公司），流動相：流動相A：100％（0.1％醋酸）水，流動相B：100％甲醇，梯度洗脫：0min：90％A和10％B，6min：80％A和20％B，6.1min：100％B，8min：100％B，8.1min：90％A和10％B，最終時間13min。流速1mL/min，柱溫30℃，波長245nm；7-羥基香豆素：色譜柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京匯德易公司），流動相：流動相A：100％（1％醋酸）水，流動相B：100％甲醇，等度洗脫，A∶B=35∶65，最終時間13min。流速1mL/min，柱溫30℃，波長320nm；6β羥基睪丸酮：色譜柱Agilent（LC-18 5μm，4.6mm×150mm）（北京匯德易公司），流動相：流動相A：100％水，流動相B：100％甲醇，梯度洗脫：0min：48％A和52％B，8min：38％A和62％B，10min：100％B，10.1min：48％A和52％B，最終時間15min。流速1mL/min，柱溫30℃，波長254nm。

1.2.6 計算方法：Km和Vmax計算，根據Lineweaver Burk方程［8］1/v=Km/Vmax×1/［s］+1/Vmax，v為反應速度，通過代謝產物量與代謝時間和蛋白濃度的比值求得，s為底物濃度，Km為最大反應速度一半時的底物濃度，Vmax為最大反應速度，用1/v對1/s線性回歸，通過EXCEL作圖即可得到一條直線方程，斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax；IC50計算［9］，通過與中藥成分共同孵育可以得到相應的代謝產量，與未加中藥成分的對照組比較，可以得到相應的相對代謝率，也可以求得相應的相對抑制率，通過中藥成分各濃度與代謝抑制百分率進行線性回歸可以求得IC50值，若IC50＞50μmol/L，說明藥物對該CYP450抑制能力弱，IC50＜1μmol/L，說明藥物對該CYP450抑制能力強，有必要獲得抑制常數Ki。

2 結果

2.1 紫杉醇對食蟹猴CYP1A2、3A4和2A6酶代謝活性的影響

紫杉醇對食蟹猴CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性有一定的抑制作用，IC50值分別為570±5.9μmol/L、140±2.9μmol/L和沒有影響無法計算，說明紫杉醇對不同CYP450酶的抑制作用都較弱，對CYP2A6酶活性幾乎沒有影響（表1）。

表1 紫杉醇對食蟹猴CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性的影響（n=3）Tab.1 The effect of paclitaxel on Cynomolgus monkey CYP1A2、CYP3A4 and CYP2A6 metabolic activity of enzymes（n=3）

表2 紫杉醇對人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性的影響（n=3）Tab.2 The effect of paclitaxel on human CYP1A2、CYP3A4 and CYP2A6 metabolic activity of enzymes（n=3）

2.2 紫杉醇對人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性的影響

紫杉醇對人CYP1A2、CYP3A4和CYP2A6酶代謝活性有一定的抑制作用，IC50值分別為193±6.6μmol/L、253±3.6μmol/L和24±1.6μmol/L，說明紫杉醇對不同CYP450酶的抑制作用有較大差異，對CYP2A6酶的抑制作用較強，對CYP1A2和CYP3A4酶活性的影響也較弱（表2）。

3 結論

紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復雜的次生代謝產物，也是目前所了解的惟一一種可以促進微管聚合和穩定已聚合微管的藥物。同位素示蹤表明，紫杉醇只結合到聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白二聚體反應。細胞接觸紫杉醇后會在細胞內積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細胞的各種功能，特別是使細胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細胞的正常分裂。通過Ⅱ-Ⅲ臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。紫杉醇是一種具有可開發前景的抗癌藥物，所以對其在臨床上使用是否有可能產生藥物相互作用非常重要，有助于評價紫杉醇的安全性，指導臨床合理聯合用藥。本實驗通過以非那西丁、睪丸酮和香豆素為探針藥物研究紫杉醇對食蟹猴和人肝微粒體CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4三種酶代謝的影響。了解紫杉醇對CYP450酶系的誘導或抑制作用，有助于指導臨床合理用藥。本文結果認為紫杉醇對不同種屬肝微粒體CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4三種酶的活性沒有較強的抑制作用，對人肝微粒體CYP2A6酶活性具有一定強度的抑制作用而對其他兩種無較強的抑制作用，說明紫杉醇與上述酶作為底物的藥物聯合用藥產生藥物相互作用的幾率很小，可以進一步證明紫杉醇作為一種抗癌發展潛力較大的藥物在臨床使用的安全性。

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