埃博拉出血熱動物模型研究進展

許黎黎，秦 川

（中國醫學科學院實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021）

埃博拉出血熱（Ebola hemorrhagic fever，EHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）引起的一種急性出血性傳染病，于20世紀70年代在非洲首次發現［1］，具有極高的傳染性，其致死率高達50％～88％［2］。由于其在自然界的宿主尚未查明，且暫無有效的抗病毒藥物和疫苗，目前對該病的預防還極為困難。世界衛生組織已將EBOV列為對人類危害最嚴重的4級病毒，因此，構建埃博拉出血熱的動物模型，對于病毒致病機理的了解和深入研究，以及治療藥物及疫苗的研發具有至關重要的作用。

1 埃博拉出血熱的血清型、臨床表現及病理改變

EBOV包括四種亞型：埃博拉-扎伊爾（Ebola-Zaire，ZEBOV），埃博拉-蘇丹（Ebola-Sudan，SEBOV），埃博拉-科特迪瓦（Ebola-Cote d’Ivoire，CEBOV）和埃博拉-萊斯頓（Ebola-Reston，REBOV）。發生在剛果（前扎伊爾），蘇丹和科特迪瓦的三種亞型埃博拉病毒已被證實能夠致人類疾病。不同亞型毒力不同，ZEBOV毒力最強，人感染死亡率高達88％；SEBOV次之，致死率約為50％；CEBOV對黑猩猩有致死性，對人的毒力較弱，致病但不致死；REBOV對非人靈長類有致死性，人感染不發病［3］。

埃博拉出血熱潛伏期約2～21d，起病急。最初的臨床表現為發熱、畏寒、頭痛、肌痛及惡心。隨后出現嚴重的腹痛、嘔吐和腹瀉。部分病例于發病5～7d出現斑疹，以肩部、手心和腳掌多見。許多病例出現結膜充血和黑便等癥狀。重癥病例皮膚黏膜和內臟均可出血，以呼吸道和腸道最為嚴重。通常死亡病例均發生出血癥狀，推測與彌漫性血管內凝血有關。

病人感染后主要的病理改變是皮膚，黏膜，臟器的出血，在很多器官可以見到灶性壞死，但是以肝臟、淋巴組織最為嚴重。肝細胞點，灶樣壞死是本病最顯著的特點，可見小包涵體和凋亡小體。

2 動物模型研究進展

2.1 小鼠模型

免疫系統完整的成熟小鼠不能感染EBOV，推測可能是由于其強大的先天免疫系統，尤其是IFN-Ⅰ型反應所導致［4］。腹腔或腦內接種病毒可對乳鼠產生致死效應［5］，推測是由于IFN-Ⅰ型免疫反應系統發育不全所導致。成熟的免疫系統缺陷小鼠，如缺失功能性B細胞及T細胞的SCID小鼠也可被EBOV感染并致死。然而，不同于人類及其他動物模型，SCID小鼠被ZEBOV攻毒后可繼續健康存活數周，然后再逐漸出現體重下降及活動減少等癥狀，20～25d后死亡［4］。缺失IFN-Ⅰ型免疫系統的小鼠，如IFN α/β受體或STAT基因敲除小鼠，也無一例外的于皮下攻毒一周內死亡［6，7］（表1及表2）。

表1 各種動物模型被野生型及傳代適應株ZEBOV感染后的主要特征Tab.1 Main infection features of ZEBOV viruses in animal models and humans

表2 ZEBOV對小鼠的感染情況Tab.2 ZEBOV infection in mice

另一途徑是通過將ZEBOV在免疫系統完整的小鼠體內連續傳代，來獲得小鼠適應株［8］（表1及表2）。感染這種小鼠適應型EBOV的小鼠于攻毒后3d發病，5～7d后死亡，死亡小鼠的肝及脾內均可檢測到滴度高達109PFU/g的病毒［8］。同時，肝和脾發生的病理改變，以及血清中的轉氨酶（天冬氨酸轉氨酶，AST；丙氨酸轉氨酶，ALT）水平，與被ZEBOV攻毒的靈長類動物模型的病理表征極為類似［6］。然而，與靈長類相反的是，小鼠組織中僅有少量的纖維蛋白沉淀，并且僅腹腔攻毒可致死小鼠，當使用其他攻毒途徑時，即使加大攻毒劑量，小鼠仍能存活。

2.2 豚鼠模型

用ZEBOV攻毒豚鼠僅能引發短時的，非致死的發熱癥狀［9］。同樣，使用ZEBOV在近交及遠交系豚鼠體內連續傳代可獲得使豚鼠致死的適應株［9］（表1）。該適應株攻毒豚鼠約5d后開始出現禁食、發熱、脫水等臨床癥狀，8～11d后無一例外的死亡，但并不伴隨出血的現象［9］。肝和脾中可于攻毒后2d檢測到病毒，3d時病毒擴散至腎、腎上腺、肺、及胰臟，隨后組織平均病毒滴度逐步上升并于9d時達到峰值，病毒血癥于7d時達到近105PFU/mL的峰值。感染的豚鼠同時還逐漸出現凝血時間（prothrombin time，PT）延長等現象［10］。

2.3 非人靈長類模型

很多非人靈長類（nonhuman primates，NHP）動物均被用于埃博拉動物模型的研究，包括非洲綠猴（Chlorocebus aethiops）［11-14］、狒狒（Papio hamadryas）［14-18］、恒河猴（Rhesus macaques）［11，19-22］、食蟹猴（Cynomolgus macaques）［12，15，23］。其中恒河猴和食蟹猴目前使用的最為廣泛，均對EBOV高度敏感，可引起與人類極為類似的臨床癥狀。食蟹猴對ZEBOV最敏感，臨床癥狀出現最快，一般3～4d，瀕死前發熱持續時間短，約2～3d。而恒河猴臨床癥狀出現時間要稍慢一些，但更接近于人類。攻毒后2d可檢測到病毒血癥的發生，并于2～3d后達到峰值。除此以外，狒狒對所有亞型EBOV均存在一定程度耐受，非洲綠猴對REBOV耐受［12，14，18］。值得一提的是，除了所使用動物模型的類型差異外，攻毒使用的毒株、劑量、及接種方式，均對模型最終所產生的臨床癥狀、病情持續時間、及嚴重程度產生不可忽視的影響。

NHP動物模型被ZEBOV攻毒后瀕死前體溫會驟然下降，體重的減輕程度也會高于10％，推測是由于脫水，而非脂肪的分解，部分動物還會出現腹瀉及間歇性黑糞癥的現象。攻毒后4d時，NHPs皮膚上通常會出現斑丘疹并持續至死亡。發病早期會出現外周淋巴結腫大，中期及晚期可見肝臟腫大并出現圓形囊狀邊緣［24］。病毒血癥通常于攻毒后2d可以被檢測出來，并于2～3d后達到峰值。同時，所有被攻毒的NHPs均出現顯著的血小板減少的癥狀，從攻毒后6d開始出現凝血時間延長的現象，至10～12d時血液失去凝集能力［22］。此外，血漿中的鈉、鉀、鈣離子水平均呈下降趨勢，而尿素和肌酸酐水平上升。從第5天開始，轉氨酶（AST，ALT）水平持續升高，直至動物死亡［22，25，26］。

關于SEBOV感染NHPs來進行動物模型研究的報道較少，恒河猴和食蟹猴被SEBOV攻毒后臨床癥狀較ZEBOV攻毒后出現的稍晚幾天，而存活率要稍高一些［12，27］。

3 討論

盡管嚙齒類動物模型與人類疾病存在一定程度的相似性，但它們感染EBOV后與人類及NHPs在臨床表征、組織病理等方面的顯著性差異導致其使用的局限性［3，7，8，28］，一些非常重要的臨床感染現象如體溫升高、斑丘疹的出現、彌散性血管內凝血（DIC）等在嚙齒類動物模型身上均無法體現［4，24］。與小鼠相比，豚鼠感染后可表現出相對而言更嚴重的凝血障礙，包括血小板數量減少、凝血時間延長等，但纖維蛋白的沉積及凝結程度仍遠低于NHPs模型［10］。此外，小鼠及NHPs感染EBOV后出現的一項重要特征，淋巴細胞凋亡現象，在豚鼠模型中也并不明顯［8，10，21］。盡管如此，在對新疫苗進行體內評估，或對新的治療方案進行制定時，嚙齒類動物模型仍然擔當著不可替代的重要作用。尤其是小鼠，可以方便獲得大量的近交系品種，或者各種不同品系的免疫缺陷型，以及各種基因改造小鼠。值得注意的是，當對基于嚙齒類動物模型所做的研究進行評估時，絕不可隨意推測其用于人類臨床治療的效果，已有大量報道指出很多抗EBOV的治療藥物及疫苗在嚙齒類動物模型身上表現出極好的保護性作用，而一旦進入NHPs模型實驗階段，卻顯示無效［21，29-31］。研究者們推測這歸因于嚙齒類與人類及NHPs免疫系統的巨大差異［32］，尤其是嚙齒類動物所特有的極強的先天免疫系統的差異所導致的［4］。

NHPs則是作為研究EBOV感染的優良動物模型，它們在臨床表征、組織病理等方面都與人類極為類似。在選擇一種合適的NHP模型時，動物的品種、性別、年齡，以及攻毒的途徑、劑量，都必須列入重點挑選及考慮范圍之內，因為這都是影響實驗結果的關鍵因素［24］。食蟹猴和恒河猴被公認為是研究EBOV感染的“金標準”模型，其中恒河猴的優勢更加明顯，因其更加廣泛的被用于制藥行業，并且其全基因組序列已被公布［24，33］。然而，由于近年來新發傳染性疾病的迅速增多，從而導致對NHPs需求的激增，以至于NHPs的供不應求及持續短缺［34］。基于此，一些新品種NHPs的開發，對于緩解目前的研究壓力及未來應對各種突發疾病的準備，具有至關重要的意義。

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