應激對小G蛋白RhoB的誘導作用

116021 解放軍第210醫院 劉亞萍 李溪 戴林

隨著對應激機制研究的深入，人們發現應激時除有神經-內分泌以及相關的功能代謝改變外，還有細胞水平的變化。這種當細胞處于不利環境和遇到有害刺激時所產生的防御或適應性反應稱為細胞應激，它存在于從單細胞生物到高等動物所有的生物體內[1]。

細胞應激可分為基因毒應激(由紫外線、離子射線、過多的活性氧、化學致畸及致癌物等引起)和非基因毒應激(由切應力、創傷、感染、缺氧和熱應激等引起)兩大類。細胞應激反應包括一系列高度有序事件，表現為應激原誘發的細胞內信號轉導，激活相關的轉錄因子和促進應激基因的快速表達，合成多種特異性和非特異性的對細胞有保護作用的應激蛋白質，從而對細胞產生特異和非特異的保護作用，同時細胞內一些正常基因的表達受到抑制。

小G蛋白Rho亞家族是一類GTP酶結合蛋白，它通過其下游效應蛋白介導參與調控多種細胞生物學功能，涉及到細胞的骨架重組、生長、凋亡、運動等[2-3]。Rho亞家族成員主要有RhoA、RhoB和RhoC，雖然RhoB和RhoA、RhoC在結構上的相似性高達87%，但它在細胞內定位、不同細胞周期中的表達情況以及調控等許多方面都顯示出其特殊性[4-5]。小G蛋白RhoB至今的研究表明其是一類GTP結合蛋白，只有與GTP結合的RhoB(活化的RhoB)才能激活下游的信號轉導通路，進而發揮復雜多樣的生物學效應[6]。RhoB屬于即時反應基因，可被多種基因毒應激因素所誘導，諸如紫外線、化療藥物(如順鉑、5-氟尿嘧啶)等[7-8]，并能抑制某些腫瘤細胞增生和誘導細胞凋亡[9-10]。

1 紫外線(UV)對小G蛋白RhoB的誘導作用

紫外線照射屬于基因毒應激，它是通過損傷DNA引起的細胞應激，紫外線依據波長一般分為UVA(320～400 nm)、UVB(290～320 nm)和UVC(240～290 nm)。其損傷DNA的機制：UVA主要通過其他分子產生活性氧間接損傷DNA的單個堿基；而UVB和UVC直接被DNA分子吸收，使DNA形成嘧啶二聚體，相鄰2個T，相鄰2個C，C與T之間均可形成二聚體，但最容易形成的二聚體是TT，結果使其不能與嘌呤配對而致DNA損傷。

Westmark等[11]發現，在分化細胞(NIH/3T3)和原代細胞(NHEK)細胞中，紫外線照射數小時后，RhoB上調，RhoB mRNA的半衰期較對照增加2～3倍，其是通過RNA結合蛋白類胚胎致死異常視覺1(HuR)結合到RhoB的3~-非翻譯區(3~-UTR)而使RhoBmRNA的穩定性增強。在紫外線的照射下A18 hnRNP從核到胞質的易位，而YB1卻移動到細胞核，同時HuR在胞質積聚。也就是說，UV誘導的轉錄后調節如甲基化和(或)磷酸化，HuR從核到胞質的穿梭運動，從而導致了ERGmRNA在胞質積聚的穩定。HuR以新的方式在細胞核結合轉錄后的ERGmRNA，通過核膜傳輸mRNA和蛋白的結合物，并且阻止了胞質中核糖核酸酶(RNase)的攻擊信息的傳遞。Fritz等[12-13]發現當紫外線照射30min后，3～4倍增加的RhoBmRNA的半衰期可以被放線菌素D(Act D)阻斷，這個轉錄激活過程不依賴p53和c-fos，但是需要完整的CCAAT RhoB的啟動元件。因此，紫外線似乎可以激活RhoB基因的轉錄和轉錄后基因的穩定性，同樣在NIH/3T3細胞中，Blattner等[14]也發現紫外線可以控制c-fosmRNA的轉錄和轉錄后水平。紫外線可能先激活細胞內的信號通路，然后快速的激活絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的蛋白激酶，如ERK[15]、SAPK/JNK[16]、P38[17]、PI3K/AKT[18]，由它們構成二級信號通路。它們激活后可活化轉錄因子NF-κB，它是由激活IκB激酶(IκK)而特異性地磷酸化IκB，磷酸化的IκB與NF-κB解離，并迅速觸發泛素-蛋白酶體途徑而降解。NF-κB中的核定位信號由此得以暴露，能夠進入細胞核，通過與κB增強子以及啟動子相互作用而促進基因的表達。活化的胞外細胞調節激酶(ERK)可通過EIk1/TGF的磷酸化促進c-fos基因轉錄，JNK能使轉錄因子c-Jun N端轉錄活性區的Ser63和Ser73磷酸化，提高c-Jun的轉錄活性。JNK也可使p53蛋白磷酸化。Bruno Cangulihem[18]的研究表明，UVB能夠誘導人角化細胞(HaCaT細胞)中RhoB的表達，RhoB的上調通過增加表皮生長因子受體(EGFR)的表達促進AKT的磷酸化(活化)，活化的AKT可抑制Bad和Caspase-9的活性而起到抑制凋亡的作用。

2 缺氧對小G蛋白RhoB的誘導作用

單純性的缺氧或缺血、缺氧可導致缺氧性細胞應激，表現為缺氧作用于細胞上的氧感受器，啟動細胞內的信號轉導通路，激活作為轉錄因子的缺氧誘導因子-1(HIF-1)或HIF-1α樣因子(HLF)。

細胞內氧的降低，也就是缺氧，存在于心臟病、急性和慢性血管疾病、肺部疾病和腫瘤中。哺乳動物細胞通過其保守的缺氧反應通路能感覺氧含量降低的水平，其也參與了生理方面的反應，如胚胎發育時期血管的形成及腫瘤的病理過程。尤其在腫瘤的發生發展過程和對放射療法的抵抗方面，缺氧是一重要的選擇力。HIF-1是基本的自身氧環境的調節器，其通過控制一系列的靶基因來參與血管增生、糖酵解、細胞增生和pH調節。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成的異二聚體。由于HIF-1β是組成性表達，因此細胞內HIF-1α的水平依賴于氧的含量。在正常氧含量的情況下，HIF-1α是由氧依賴的特殊的脯氨酰羥化酶組成的脯氨酰羥化物，其需要氧、亞鐵離子和2-酮戊二酸來激活。已經知道的有3種脯氨酰羥化酶，但是最近的研究表明脯氨酰羥化酶2是常氧狀態下HIF-1α低水平狀態下關鍵的氧傳感器[19]。低氧時，脯氨酰羥化酶停止其功能，HIF從降解中解離出來。除此以外，缺氧信號轉導也需要激酶/磷酸酶的激活。Wang等[20]的研究指出，在細胞治療的時候用酪氨酸激酶抑制劑或蘇/色氨酸抑制劑磷酸酶的抑制劑及氟化鈉都可以阻斷缺氧誘導的HIF-1α的表達。除此以外，PI3K/AKT信號通路調節缺氧誘導的HIF的激活[21]。例如，Zhong等[22]的研究表明，在用藥理學物質治療人前列腺癌細胞時，PI3K和AKT的靶基因抑制HIF-1α的表達。有活性的PI3K活化AKT后，依次的抑制糖原合成激酶(GSK-3)自身的Ser21和Ser9的磷酸化。另一方面，GSK-3的活性可以被Tyr279/Tyr216的磷酸化上調，最新的研究表明，這是細胞內的自磷酸化反應[23]。GSK-3第一次被提出可以調節糖原合成酶的活性，并且已經被證明其是糖原合成的負調節因子，還可以通過磷酸化調節許多轉錄因子。最近的研究表明，延長缺氧時間可以激活GSK-3β和降低HIF-1α蛋白，表明GSK-3β可以調節HIF-1α蛋白的穩定性[21-24]。缺氧時，HIF-1α的穩定性可以被許多小G蛋白所控制，包括RhoA、RhoB、Rac1和cdc42。Skuli等[25]的研究表明，在缺氧30min時，RhoB就激活了，表明RhoB可能是抵抗缺氧時的敏感器，它的激活會誘導缺氧誘導的信號轉導通路，然后使腫瘤細胞適應自身的新環境。他還發現RhoB調節細胞內HIF-1α的水平是由于激活HIF-1α蛋白水解造成的，因此證明了缺氧時RhoB參與了蛋白酶依賴的HIF-1α的調節。缺氧時線粒體中ROS的含量會增加，ROS是缺氧誘導轉錄反應所必須的，缺氧時RhoB可以被ROS激活，其他的小G蛋白在缺氧時也可以通過ROS被激活。RhoB被ROS激活可能也通過特殊的GAP或GEF的調節，至于其準確的機制，目前尚不清楚，有待于進一步的研究。

3 Toxin A對小G蛋白RhoB的誘導作用

Toxin A來自艱難梭狀芽孢桿菌，它是抗生素相關性腹瀉的主要致病因子，它可以使Rho GTP酶失活[26-27]。RhoB是唯一的膜結合的，其局限在細胞膜和早期的內含體中[28-30]，它促進轉化和細胞凋亡的過程可能是通過調節細胞表面受體的的胞內運輸來完成的[31]。已有的研究表明DNA損傷誘導的凋亡尤其需要RhoB的參與，盡管RhoB不直接誘導凋亡。早期的研究表明，RhoB積極的參與細胞的增生，但是近期的研究表明RhoB更多是細胞凋亡的調節劑，而不是誘導劑。因此，RhoB成為抗腫瘤治療過程中一個有希望的靶基因。

Gerhard等[32]的研究表明，Toxin A可以使RhoB蛋白持續上調，其在8 h達到穩定，可以持續24 h，但是由于RhoB的半衰期大約是2 h，因此，長時間上調的RhoB可能是由抑制RhoB降解的抑制劑造成的。但是抑制新蛋白合成的抑制劑放線菌素可以完全阻止RhoB的合成。當在穩定狀態時加入放線菌素時，可以導致RhoB水平快速的下降。因此，在加入Toxin A 8 h后，其長期持續的新蛋白的合成和蛋白的降解，達到了平衡狀態，在此情況下，RhoB起蛋白轉換作用。因為RhoB是Toxin A的底物，它是直接由葡萄糖基化作用引起的失活，應該導致靶細胞中葡萄糖基化作用后失活的RhoB增加。可是意想不到的是，大量增加的RhoB只有部分是葡萄糖基化作用后的，仍有大約40%是未修飾的RhoB。實驗表明，未修飾的RhoB至少有部分是激活的。在用Toxin A處理后的細胞中新合成的RhoB大部分定位于細胞膜，而不是內含體，這些胞膜上的RhoB沒有發現RhoA信號通路的孤兒核作用的調節蛋白，這些就是激活了的RhoB。他們還發現RhoB的上調是由Toxin A糖基化后的Rac1引起的，其是通過阻斷PI3K/AKT通路來完成的。總之，Toxin A可以通過p38 MAPK誘導小G蛋白RhoB的上調，上調的RhoB僅僅部分失活，大部分的RhoB激活，并形成下游的信號通路。因此，Toxin A不再完全是小G蛋白的抑制劑，它也可以激活小G蛋白，其可以有助于對Toxin的治療方法。但是Toxin在體內引起的促反應仍有待于進一步研究。

綜上所述，應激反應是個復雜的過程。表現為一種應激原常能同時或順次激活幾條信號轉導通路，不同應激原可激活多條信號轉導通路。激活的信號能促進轉錄因子表達和(或)提高其轉錄活性產生生物效應。轉錄因子之間存在相互促進或抑制的作用，其生物效應也可能相反。這表明應激反應在分子水平存在非常復雜的反應和巧妙的調控機制。至于小G蛋白RhoB至今的研究表明其是一類GTP結合蛋白，只有與GTP結合的RhoB(活化的RhoB)才能激活下游的信號轉導通路，進而發揮復雜多樣的生物學效應。已有的實驗證實，應激對RhoB的影響不僅能夠誘導其表達也能夠使其活化[33]。至于應激誘導RhoB的機制和產生的生物學效應，不同的應激原其表現不同[34-35]，需要我們今后進一步的研究來闡明。

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