228株結核分枝桿菌MLVA分型研究

同重湘，趙秀琴，馬建軍，劉志廣，曹文靜，楊永紅，呂冰，姜元，萬康林*

（1.甘肅省蘭州市肺科醫院檢驗科，甘肅蘭州730046；2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所/傳染病預防控制國家重點實驗室，北京102206）

228株結核分枝桿菌MLVA分型研究

同重湘1，趙秀琴2，馬建軍1，劉志廣2，曹文靜1，楊永紅1，呂冰2，姜元1，萬康林2*

（1.甘肅省蘭州市肺科醫院檢驗科，甘肅蘭州730046；2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所/傳染病預防控制國家重點實驗室，北京102206）

目的：通過多位點可變數目串聯重復序列（MLVA）分型，了解甘肅省臨床分離結核分枝桿菌菌株基因型情況。方法：選擇標化的15個VNTR位點，對臨床分離菌株DNA進行檢測，DNA指紋圖譜使用BioNumerics 4.5軟件進行統計分析，得出聚類分析結果。結果：228株結核分枝桿菌被分為4大基因群，7個主要基因型，分別包含13（5.7%）、3（1.3%）、7（3.1%）、1（0.4%）、171（75.0%）、31（13.6%）、2（0.9%）個菌株；在株水平基因分型上，93（40.8%）株為獨立基因型；其余菌株基因型分別包含2～10株結核分枝桿菌，共構成132個基因簇。結論：甘肅省臨床分離結核分枝桿菌菌株存在豐富的基因多態性，MLVA方法具有較高的基因分型能力，可以滿足結核分枝桿菌株水平DNA分型的需要。甘肅省臨床分離結核分枝桿菌菌株主要為北京家族基因型菌株。

結核分枝桿菌；多位點可變數目串聯重復序列；基因分型；北京家族基因型

目前，基因分型技術廣泛應用于各種病原微生物的研究。結核分枝桿菌的基因分型鑒定，對結核病流行病學調查、結核病監測、傳染源發現、傳播途徑、發病機制、耐藥機制以及病原進化的研究均有非常重要的意義。隨著分子生物學技術的飛速發展，基因分型方法在結核分枝桿菌分型中的應用逐步得到完善。MLVA方法是眾多基因分型方法中較為成熟一種[1]，其基本原理是結核分枝桿菌基因組DNA存在獨立的可變數目串聯重復位點（variable number of tandem repeats，VNTR），VNTR具有高度多態性，在結核分枝桿菌中表現出株水平的特異性[2]。對多個VNTR位點進行檢測，可以將菌株分為不同的基因型。MLVA分型方法操作簡便，能夠提供完整的數字信息，便于利用計算機軟件進行統計分析，且穩定性和重復性高，在實驗室內具有非常好的可比性。該方法曾用于北京、廣西、西藏及陜西等省份結核分枝桿菌基因分型的研究，取得了很好的效果。據2007年統計，甘肅省結核患者31 057例，死亡106例，報告發病率及死亡率分別較上年上升10.2%和22.7%，在結核病防控、診療過程中，是否可借鑒其他省份的先進經驗呢？首先要看我省臨床分離的結核分枝桿菌在基因分型上與其他地方是否存在同源性，這將對我省結核病防治工作者在結核病防控、診療過程中制訂防控策略提供理論依據。下面就蘭州市肺科醫院臨床分離的228株結核分枝桿菌做一研究分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

入選的228株結核分枝桿菌菌株于2005年4月～2007年6月由甘肅省蘭州市肺科醫院分離提供，其中敏感菌株100株，均由初治病例分離；耐藥菌株128株，均為耐多藥菌株，其中107例由臨床復治病例分離，21例由初治病例分離；結核分枝桿菌標準株H37Rv由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所實驗室保存提供。

1.2 主要試劑

2xPCR-Mix（2倍PCR預混液）購自天根生物技術公司，100 bp DNA ladder（MBI Fermentas）購自上海生工公司，瓊脂糖（Biowest）購自基因公司，引物由上海生工合成。

1.3 VNTR位點選擇和操作步驟、方法

參見文獻[3-4]。

1.4 數據分析

輸入至電子表格的菌株VNTR數據，用BioNumerics 4.5軟件進行分析，得出聚類分析圖。

2 結果

228株臨床分離結核分枝桿菌根據VNTR重復次數，經BioNumerics（Version3.0）軟件聚類分析后被分為4大基因群，分別包含菌株23、1、202、2株菌，其中最大的基因群為北京家族基因型，共包含202株結核分枝桿菌。主要基因類型有7個，分別包含13（5.7%）、3（1.3%）、7（3.1%）、1（0.4%）、171（75.0%）、31（13.6%）、2（0.9%）個株菌；在株水平分類上228株結核分枝桿菌被分為132個基因型，其中93株為單菌株獨立基因型，其余135株菌分屬39個基因型，各包含2～10株菌。

3 討論

本研究中筆者選取了228株2005～2007年甘肅省蘭州市肺科醫院臨床分離的結核分枝桿菌不同分類菌株作為研究對象，菌株構成具有較強的代表性，基本包含了近年來本地區的流行菌株。結果表明，甘肅省主要流行株為北京家族（Beijing family）菌株，占絕大多數（202株，88.6%）。北京家族菌株在所選取的15個VNTR位點中，等位基因多態性由低到高排列分別為：ETR-C，ETR-B，MIRU23，ETR-D，Mtub30，MIRU27，MIRU39，Mtub39，MIRU10，ETR-A，MIRU40，ETR-E，MIRU26，MIRU16，Mtub21，其中前5個位點具有較高的一致性，其他位點可略有不同，差異主要集中在Mtub21、MIRU16、MIRU26、ETR-E等位點上。

在VNTR位點選擇上，筆者兼顧了基因群的劃分和基因型分辨能力的優化。分辨率低的位點在群分類上意義明顯，分辨率高的位點在基因型分類上作用較大，有關VNTR位點分辨能力的研究可參考文獻[4]。北京家族菌株廣泛分布于中國及周邊國家，歐洲及美洲分布較少。以往認為，北京家族基因型菌株的形成與耐藥突變及BCG接種相關[5-7]，但近年來也有研究表明，北京家族基因型菌株與上述因素無相關性[8]，從該基因型菌株近年來的流行趨勢分析，其易感人群廣泛、傳播速度快是其顯著特點之一。因此，加強對該基因型菌株生物學特性的研究和流行病學監測，對今后結核病的防控具有極為重要的意義。

在株水平基因分型方面，228株結核分枝桿菌被分為132個基因型，其中93株為單菌株基因型，說明本研究選用的15個VNTR位點分型效果較為理想，具有較強的基因分型能力，有一定的應用價值。株水平分型在追蹤結核病傳染源、結核病暴發流行調查等方面具有非常重要的意義。

綜上所述，本次研究使筆者對臨床分離結核分枝桿菌基因型情況有了較為細致的了解，同時也為筆者今后的研究方向、制訂防控措施以及臨床診療提供了一定的理論依據，達到了預期目的。

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[2]Skuce RA,McCorry TP,McCarrol JF,et al.Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTR-PCR targets[J]. Microbiology,2002,148:519-528.

[3]呂冰,Pourcel C,劉敬華,等.結核分枝桿菌多位點可變數目重復序列分型方法標準化程序的建立[J].中華流行病學雜志,2008,29(9):919-924.

[4]呂冰,李兆娜,劉梅,等.45個可變數目串聯重復序列位點用于中國結核分枝桿菌基因型鑒定的分辨力評價[J].中華流行病學雜志,2009,30 (1):63-67.

[5]Spurgiesz RS,Quitugua TN,Smith KL,et al.Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis by using nine novel variable-number tandem repeats across the Beijing family and low-copy-number IS6110 isolates[J]. J Clin Micro,2003,41:4224-4230.

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[7]Deborah M,Gascoyne-Binzi.Rapid identification of laboratory contamination with mycobacterium tuberculosis using variable number tandem repeat analysis[J].J Clin Microbiol,2001,39:69-74.

[8]石荔,范昕建,萬康林.多位點可變串聯重復序列技術用于西藏地區結核分枝桿菌基因分型的初步研究[J].中華流行病學雜志,2007,28(5): 477-481.

Analysis on the 228 Mycobacterium Tuberculosis with MLVA

TONG Chongxiang1,ZHAO Xiuqin2,MA Jianjun1,LIU Zhiguang2,CAO Wenjing1,YANG Yonghong1,LU Bing2,JIANG Yuan1,WAN Kanglin2*
(1.Department of Clinical Laboratory,Lanzhou Pulmonary Hospital,Lanzhou730046,China;2.National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,Beijing102206,China)

Objective:By Multiple locus variable numbers of tandem repeats(MLVA)genotyping,to analyze the genotypes of epidemic Mycobacterium tuberculosis strains in Gansu.Methods:15 standardized MLVA loci were used to type the clinical isolated M.tuberculosis strains of Gansu.Results were analyzed with BioNumerics 4.5.The dendrogram was summarized from the fingerprintings.Results:The result of MLVA showed that 228 strains of M.tuberculosis were classified 4 major genetic groups and 7 main genotypes.The largest genotype included 171(75.0%)strains,the others were 13(5.7%),3(1.3%),7(3.1%),1(0.4%),31(13.6%)and 2(0.9%)respectively.Farther particulars,93 strains(40.8%)were belong to unique genotype.The other strains contained 2-10 M.tuberculosis,all 132 geno-clusters.Conclusion:The bacterium strains of M.tuberculosi in Gansu has a rich nucleotide polymorphisms.MLVA is very useful to type the genotype of M.tuberculosi strains.Beijing family genotype strain is the dominant genotype in Gansu.

Mycobacterium tuberculosis;Multiple Loci VNTR analysis;Genotyping;Beijing family genotype

R378.911

B

1673-7210（2010）06（a）-097-02

2010-01-14）

國家自然科學基金資助項目（30771853）；甘肅省蘭州市重點科研項目（07-1-94）

*通訊作者