胸膜肺炎放線桿菌血清 8型自轉運黏附素基因克隆測序及功能區對比

王 瑜,雷連成,韓文瑜,謝 芳,李林溪,周 靚,楊舒心,胡本鋼,邢艷蘋,計 群,路 榮,劉曉賀,何伯萍

(吉林大學畜牧獸醫學院,吉林長春,130062)

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是豬傳染性胸膜肺炎的病原菌。豬傳染性胸膜肺炎是一種高度傳染性和致死性的呼吸系統疾病,它主要經呼吸道感染并且具有專一性的侵害豬的肺臟。所以,在該菌的定植過程中,黏附成為該菌感染不可缺少的生存定居的過程[1]。2002年,Ingrid Van Overbeke等[2]研究發現,APP黏附于宿主細胞的過程可能是由多因素多因子共同參與完成的。而目前有關 APP黏附作用的研究寥寥無幾,僅有脂多糖(LPS)、菌毛等[3～5]。由此推測,含有一些潛在的黏附因子尚未被發現,有待進一步研究。

吉林大學和平校區畜牧獸醫學院微生物實驗室在前期研究中,首次發現 APP存在三聚體自轉運黏附素[6],并發現其在不同血清型中的三聚體自轉運黏附素存在著顯著的差異,其中血清 5b型具有完整的三聚體自轉運黏附素的結構。但是,目前對于該蛋白的黏附功能尚不明確。筆者在生物信息學分析的基礎上,將首次獲得的 APP血清 8型基因序列與APP血清 3,5b,7型進行對比,以及基因序列進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株

胸膜肺炎放線桿菌(APP)血清 8型 CVCC 405菌株購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心(CVCC);大腸桿菌 DH5α菌株購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試劑

腦心浸液(Brain Heart Infusion,BHI)、馬血清、NAD(sigma)等購自北京鼎國生物試劑公司;AxyPrep BacterialGenomic DNA Miniprep kit(Axygen),QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN),DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche)等試劑盒分別購自長春維特潔、長春聯星生物公司、長春科隆生物工程用品經銷部;限制性內切酶 SalⅠ,EcorⅠ,La Taq,dNTP(TaKaRa)等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 培養基

腦心浸液(BHI)液體培養基按文獻介紹的方法配制[15],高壓滅菌,待溫度降到約 50℃時,加入 1/200的 NAD,質量濃度為 50 g/L的小牛血清,搖勻,倒平皿,4℃保存。

1.4 基因組 DNA的提取

APP菌株血清 8型 CVCC405接種于 2m L BHI液體培養基,37℃振蕩培養 12 h,10 000 r/min,離心3 min,收集菌體。采用 AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep kit(Axygen)提取基因組,具體操作方法參照試劑盒說明書,質量濃度為 7 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 PCR擴增條件

通過 APP血清 5b(L20)型的自轉運黏附素 N端 3 875 bp設計引物,以 APP血清 8型 CVCC 405為模板,擴增序列。PCR擴增體系:5 L 10×La Taq Buffer,5μL dNTPMixture(2.5mmol/each),1μL Primer(上)(50μmol/L),1μL Primer(下)(50μmol/L),2μL APP血清 8型基因組,0.5μL La Taq(5×106U/L),dd H2O補至 50μL。

PCR擴增程序:95℃預變性 5min;94℃1m in,50℃ 2m in,72℃4min,進行 30個循環,最后 72℃10 min。PCR產物用質量濃度為 10 g/L的瓊脂糖凝瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 PCR產物的回收

采用AxyPrep DNAGel Extraction kit(Axygen)對PCR擴增的目的片斷進行回收,具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.7 克隆與測序

將回收的 PCR產物連接到 pMD18-T載體上按資料介紹的方法[7]連接過夜,轉化大腸桿菌 DH5α,經氨芐抗性篩選得到陽性克隆,酶切鑒定,對陽性重組質粒,送上海生工生物工程有限公司測序。

1.8 序列比對分析

應用生物信息學軟件將獲得的 APP血清 8型核酸序列進行分析,應用 DNAMAN軟件進行多重比對及同源性分析,結果用于系統進化分析。

1.9 APP血清 8型自轉運黏附素的生物信息學分析

1.9.1 SMART軟件在線分析 使用在線分析軟件 SMART(http://SMART.embl-heidelberg.de)對測序后推斷的 APP血清 8型自轉運黏附素的編碼蛋白進行分析;同時對 Genbank報道的 APP血清 5b型和7型自轉運黏附素序列(登錄號:CP000569.1和 CP001091.1)進行分析。

1.9.2 信號肽分析 使用信號肽分析軟件 SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽。

1.9.3 黏附功能區的預測 使用生物信息學軟件 SMART(http://SMART.embl-heidelberg.de)和自轉運黏附素分析軟件 daTAA(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/dataa)對黏附基序進行分析,并預測黏附的重要功能區域。

2 結 果

2.1 PCR擴增

應用本實驗室設計的引物對 APP血清 8型基因組進行擴增,得到約 3 000 bp的特異性條帶(圖 1)。

2.2 序列測定

圖 1 PCR擴增結果電泳圖 APP血清 8型,

通過 DNAStar軟件分析,表明序列長度為 3 366 bp,與血清 5b型相比缺失了 509 bp的氨基酸。該基因編碼 1 122個氨基酸。

2.3 序列分析

使用 DNAMAN軟件對測序得到的 APP血清 8型核苷酸序列與 GenBank中已知的 3,5b,7核苷酸序列進行比較分析,結果顯示序列的一致性為 77.2%,核苷酸序列存在著差異(表 1)。

表 1 不同血清型的APP序列比對

通過 DNAstar軟件對測序得到的序列分析,發現 APP血清 8型序列抗原性高(圖 2)。通過 DNAstar對序列分析,結果表明所得序列是一個完整的閱讀框。

圖2 DNAStar軟件對 APP血清 8型自轉運黏附素的抗原性分析

2.4 核苷酸序列同源性分析

由序列比對結果可知 APP血清 8型核苷酸序列與 GenBank已知血清型序列比對同源性 92%～93%,其中與 APP血清 7型同源性最高 93%,與 APP血清 3,5b型同源性均為 92%。

2.5 系統發生樹進化分析

比較結果分為 2大分支,APP血清 8型系統發生樹進化關系見圖 3。其中血清 8型與 APP血清 3,5b型親緣關系比較近,APP血清 7型在另一個分支簇。

圖 3 根據測序結果所做的系統發生樹進化樹

2.6 結構及功能分析

使用信號肽分析軟件 SignalP 3.0對信號肽區域進行預測,結果顯示,APP血清 8型 1-16 aa為信號肽區域(圖 4)。使用蛋白分析軟件 SMART對黏附基序進行分析,結果發現血清 8型大量的 Hep_Hag基序密集分布在 132～524 aa處,與 APP血清 5b型、APP血清 7型相比各后移了 6 aa(圖 5)。使用自轉運黏附素分析軟件 daTAA對黏附基序進行分析,結果發現血清 8型大量的 Ylhead基序密集分布于 130～618 aa處,與 APP血清 5b型、APP血清 7型相比各后移了 6 aa(圖 6)。

分析證明,這段序列為三聚體自轉運黏附素結構,并且是完整的 N末端結構,有著非常好的信號肽區域。

3 討 論

本實驗采用 PCR方法對 APP血清 8型進行擴增,所得片段為 3 366 bp,首次獲得 APP血清 8型的基因序列并提交 GenBank(bankit1392817 HQ399552)。測得序列比對結果顯示,所得序列為胸膜肺炎放線桿菌。比對中發現,與已知的序列一致性僅達到 77.2%。通過 DNAstar軟件對得到的序列分析發現,APP血清 8型序列抗原性高。對序列分析結果表明,所得序列是一個完整的閱讀框,起始密碼子為ATG,終止密碼子為 TAA,并且是一個功能蛋白,該基因編碼 1 122個氨基酸。通過比對發現,這段序列可能是三聚體自轉運黏附素的一段序列。由序列比對結果可知,與 GenBank已知血清型序列比對同源性 92%～93%,其中與APP血清 7型自轉運黏附素的 N段序列同源性最高,達 93%;與 APP血清 5b型自轉運黏附素的 N段序列同源性均為 92%。

圖 4 SignalP 3.0軟件對 APP血清 8型自轉運黏附素的信號肽分析

圖5 SMART軟件對 APP血清 5b,8,7型自轉運黏附素的黏附基序比對分析

圖 6 daTAA軟件對 APP血清 5b,8,7型自轉運黏附素的黏附基序比對分析

自轉運黏附素的序列排布具有典型的特征,包含 N末端信號肽(signal peptide)、中間的承載結構域(passenger domain)、C末端的轉運單位(translocation unit)。其中,承載結構域是決定自轉運黏附素的功能的區域[8]。因此,首先需要運用使用信號肽分析軟件 SignalP 3.0對信號肽區域進行預測,結果顯示APP血清 8型 1～19 aa為信號肽區域。目前對三聚體自轉運黏附素的研究認為,承載結構域 N端的頭部是介導黏附的關鍵區域[8]。使用蛋白分析軟件 SMART發現,血清 8型大量的 Hep_Hag基序密集分布于 132～524 aa處,與 APP血清 5b型、APP血清 7型相比各后移了 6 aa;Hep_Hag基序與細菌的黏附、聚集和侵入密切相關;YadA是最早發現的三聚體自轉運黏附素,三聚體自轉運黏附素的轉運單位極為保守,此后在其他細菌中發現的所有三聚體自轉運黏附素都是由于其轉運單位與 YadA的相似而被歸類于三聚體自轉運黏附素亞家族[8,9]。隨后使用 daTAA軟件對其是否為三聚體自轉運黏附素進行進一步確定。daTAA是專門用于分析三聚體自轉運黏附素的基序和蛋白域的軟件[10],其他的蛋白,包括傳統的自轉運蛋白,都不能用此軟件得到分析結果。使用自轉運黏附素分析軟件 daTAA結果發現,血清 8型大量的 Ylhead基序密集分布于 130～618 aa處,與 APP血清 5b型、APP血清 7型相比各后移了6 aa,與 SMART分析的結果基本一致,Ylhead就是 YadA-like head,此基序含有 YadA頭部的 NSVAIG-S序列[16];由這兩種軟件的分析結果及信號肽分析結果,此序列為三聚體自轉運粘附素 N端序列,預測自轉運黏附素 N端 20～618 aa為黏附的重要功能區域,使用 DNAStar軟件分析該段具有良好的抗原性。2009年,Auger和 Labrie等[10,11]進行 APP體外黏附豬肺上皮細胞實驗和生物被膜形成實驗時,都發現了自轉運黏附素基因上調表達。這些研究說明自轉運黏附素參與了 APP的黏附、聚集和生物被膜形成,可能是 APP新發現的重要的毒力因子。但是,目前的研究仍未對自轉運黏附素的黏附功能進行進一步的研究證實,所以隨后的實驗是非常重要的。

研究還發現,許多自轉運黏附素具有免疫保護作用,能激活 B細胞,并且其抗體可阻斷細胞黏附或動物感染,這證明自轉運黏附素可能成為疫苗的候選因子,在疫苗研制方面具有非常重要的價值[12]。百日咳桿菌的自轉運黏附素 pertactin(PRN)已經作為一種疫苗組分添加到商品化的無細胞百日咳疫苗中[13]。所以,APP的自轉運粘附素的研究有著商業性的歷史意義。開展進一步的研究,證明自轉運粘附素與 APP的毒力的關系,及其功能區的研究有著深遠的意義。

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(責任編輯:朱寶昌)