單用A23187誘導外周血單個核細胞成樹突狀細胞及其介導耐藥腫瘤細胞殺傷的實驗研究

王寶中 王麗萍 王彥文 張麗華 孫桂明

1 材料與方法

1.1 材料來源

MCF-7/ADM(耐阿霉素乳腺癌細胞系)由中國醫學科學院血液病研究所惠贈。A23187為SIGMA公司產品；rhGM-CSF為廈門特寶公司產品；rhIL-4、rhTNF-a為STRATHMANN BIOTECH GMBH產品；RPMI1640干粉(美國GIBCOBRL)；MTT試劑、二甲基亞砜(DMSO)均購自SIGMA公司。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 鈣離子載體(A23187)誘導單核細胞

1.2.2 聯合細胞因子誘導單核細胞

1.2.3 收獲樹突狀細胞的鑒定

1.2.3.1 形態學 細胞形態學分析，倒置顯微鏡下觀察細胞并攝影。

1.2.3.2 免疫表型 用于細胞表面標志檢測的單克隆抗體分別為PE結合的鼠抗人CD1a、HLA-DR、CD83、CD80單抗及CD86單抗。

1.2.3.3 DCs激活T淋巴細胞

DC誘導特異性CTL的產生:參考文獻[4]T淋巴細胞與負載特異性抗原DC按1:100效靶比混合培養72小時，收集細胞即為CTL。

1.2.3.4 MTT殺傷試驗

參照文獻[4]并略作改動。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 誘導培養單個核細胞形態學變化的特點

培養24小時后，光鏡下見CK組誘導細胞體積增大并增殖，而A23187組除上述改變外，少數細胞已可見2～3個刺狀突起。48小時后兩組均見明顯多形性，CK組部分細胞也可見少許突起。培養3天后，具有刺狀突起的細胞數量增多，且突起更為明顯，培養至7天時，多數細胞呈典型的DC形態。見圖1、2。

2.2 不同誘導方式誘導DC速度的比較

不同時間各組細胞因子對K562-DC的誘導率見表1。結果表明A23187組誘導率在3天，7天時均明顯高于CK組(P均＜0.05)，且A23187組3天時的誘導率已明顯高于CK組7天時的誘導率(P均＜0.01)。

2.3 誘生DCs介導CTL對耐藥細胞的殺傷效應

誘生DC介導的CTL(DC活化CTL的比例為1:100)對靶細胞殺傷率(MCF-7/ADM)的比較見表2。從表中數值各組DC均能激活異基因淋巴細胞并介導其對MCF-7/ADM細胞殺傷，且隨效靶比的增高，殺傷率也升高；且兩組之間差別無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

本課題通過聯用GM-CSF、IL-4和TNF-α與A23187成功的誘導外周血單個核細胞成DC，并通過對二者的比較發現鈣離子載體能更快速有效地誘導出功能活性的樹突狀細胞。在應用180～275ng低濃度的A23187時，PBMC能在24小時左右即可有部分細胞呈現出DCs的形態，72小時誘導率達60%左右，明顯高于聯用細胞因子組；且培養3天后各種表面標志的表達均與細胞因子培養7天組相同。這均提示與聯合細胞因子組相比，A23187能更快速有效地將PBMC細胞誘導成為DCs。為了進一步證明此種方法誘導DC的可靠性，我們又從表型及功能方面進行了研究，結果發現經A23187誘生的DCs具有較細胞因子組相似或更強的刺激異基因淋巴細胞增殖的能力，而且證實該種來源的DC介導了CTL對耐藥腫瘤細胞較強的殺傷作用。

表1 不同時間各組細胞因子DC的誘導率比較()

表1 不同時間各組細胞因子DC的誘導率比較()

注:實驗重復3次。

組別誘導率3d 7d A23187組 58.8±18.6 24.5±15.1 CK組 66.5±11.4 48.5±15.3

表2 不同因子誘生DC介導的CTL對靶細胞的殺傷效應()

表2 不同因子誘生DC介導的CTL對靶細胞的殺傷效應()

注:實驗重復3次。

組別 效靶比10:1 20:1 40:1 80:1 A23187-DC 12.75±2.87 21.25±9.64 32.44±10.27 43.78±12.19 CK-DC 9.59±8.47 24.04±3.43 28.82±13.78 48.25±15.56

圖1 A23187誘導的PBMCDC(×400倍)

圖2 聯合CK誘導的PBMCDC(×400倍)

[1]Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immuneogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9:271-296.

[2]St.Louis DC,Woodcock JB,Fransozo G,et al.Evidence for distinct intracellular signling pathways in CD34(+)progenitor to dendritic cell differentiation from a human cell model[J].J Immun,1999,162:3237-3248.

[3]孟冬梅,趙春亭,吳少玲,等.急性髓細胞白血病細胞來源的樹突細胞的誘導及功能研究[J].中國實驗血液學雜志,2004,12:625-631.

[4]趙春亭,王寶中,孟冬梅,等.單用A23187快速誘導K562細胞分化成樹突細胞的研究[J].中華血液學雜志,2005,26:408-412.