G蛋白在快速老化癡呆小鼠SAMP8腦組織中的表達*

闞伯紅 張海霞 于建春 韓景獻

G蛋白是位于細胞膜上重要的信號轉導蛋白，可被膜受體G蛋白結合受體（GPCR）激活，傳遞多種膜外信號進入膜內。Gαq/11可激活磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C，而GαS和Gαi/o參與腺苷酸環化酶的激活和抑制。越來越多的研究表明在阿爾茨海默病（AD）中存在G蛋白信號轉導的異常[1-3]。本研究利用Western-blot方法分別檢測快速老化癡呆小鼠SAMP8和相應月齡的正常老化小鼠SAMR1中Gαq/11、Gαi和GαS蛋白的表達情況，為AD的發病研究和治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 甘氨酸、Tris堿、丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺等購自BBI公司，SDS和BCA蛋白檢測試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，蔗糖購自北京普博欣生物公司，脫脂奶粉購自BD公司，磷酸二氫鈉、甲醇和氯化鈉等購自天津市化學試劑公司，Tween-20購自北京鼎國公司，兔多克隆抗體Gαs、兔多克隆抗體Gαi、PVDF膜和ECL發光試劑盒購自美國Millipore公司，兔多克隆抗體Gαq/11購自美國Santa Cruze公司，親和純化山羊抗兔IgG購自美國KPL公司，漿膜蛋白提取試劑盒購自BioVision公司（Catalog#K268-50）。

1.1.2 主要儀器 DYY-11型電泳儀、DYCA-24D雙垂直板電泳槽購自北京市六一儀器廠，高能小型轉膜儀、UNIVERSAL 16R高速臺式冷凍離心機均購自美國GE公司，TS-1型脫色搖床購自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司，Quantity one凝膠成像系統購自BIO-RAD公司，AL104型電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，酶標儀購自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及飼養方法 所取雄性小鼠均由天津中醫學院第一附屬醫院實驗動物中心提供，均為二級實驗動物。所有實驗動物都在完全一致的生活環境和飲食條件下飼養，進食方式為自由進食，在特制的鼠籠，每籠5只小鼠，每周更換鼠籠一次，室溫為（22±2）℃，以排除飲食及環境等所有可能對實驗動物基因表達產生影響的因素。選取8月齡雄性SAMP8 5只，8月齡雄性SAMR1 5只，另取18月齡雄性SAMP8 5只，18月齡雄性SAMR1 5只，以SAMR1作為正常對照組。

1.2.2 漿膜蛋白的制備 脫臼處死后迅速取出海馬和大腦皮質組織，用預冷的生理鹽水洗去血漬，稱質量后完全按試劑說明書制備漿膜蛋白。-70℃保存。

1.2.3 Western-blot方法測定G蛋白表達水平 將漿膜蛋白溶解于適量的PBS（含0.5%Triton X-100）緩沖液，以BCA法測定蛋白濃度,以上述緩沖液將蛋白濃度調成一致，加入5×上樣緩沖液。100℃變性5 min，瞬時離心。用10%的聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，用Amersham公司生產的彩虹預染Marker作為分子質量依據，樣品每孔上樣量40 μg，上8板膠，其中2板用于染色確定上樣量的一致性，另6板用電轉移的方法轉移到PVDF膜上。沿分子質量標記將膜剪成上下兩部分，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別與Gαq/11（1∶1 000）、Gαi（1∶2 000）和Gαs（1∶1 000）抗體4℃過夜。以TBST洗去未結合的抗體后，將膜與辣根過氧化物酶標記的IgG（1∶2 000）抗體室溫作用2 h。TBST充分洗滌后，用增強型ECL試劑盒顯影1 min，置于凝膠成像系統下拍照。

1.2.4 Western-blot的結果分析和質量控制 對拍照結果進行分析，結果用相對表達量表示。質量控制時，根據分析同時電泳副本膠的影像來校準上樣量的偏差，同一板膠同時上對照組和實驗組的樣品排除不同批次在條件不同時造成的影響。

1.3 統計學處理 實驗數據使用SPSS 16.0統計軟件處理，數據采用均數±標準差（±s）表示，兩組之間比較，采用兩樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白在8月齡小鼠中的表達 與同月齡SAMR1相比，SAMP8皮質和海馬中Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白在18月齡小鼠中的表達 小鼠SAMP8皮質和海馬中Gαq/11的表達量均低于同月齡對照小鼠SAMR1的表達量（P＜0.05），而Gαi的表達量只在海馬中明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 月齡小鼠2組間皮質、海馬中蛋白的相對表達量 （n=5，±s）

表1 月齡小鼠2組間皮質、海馬中蛋白的相對表達量 （n=5，±s）

均P＞0.05

皮質 海馬組別SAMR1 SAMP8 t Gαq/11 9.81±2.35 10.19±2.66 0.24 Gαi 11.70±4.50 8.30±1.37 1.62 Gαs 10.21±2.16 9.79±1.26 0.38 Gαq/11 11.01±6.91 8.99±4.89 0.53 Gαi 11.20±5.03 8.80±3.06 0.91 Gαs 11.06±4.17 8.94±3.79 0.83

表2 18月齡小鼠2組間皮質、海馬中蛋白的相對表達量 （n=5，±s）

表2 18月齡小鼠2組間皮質、海馬中蛋白的相對表達量 （n=5，±s）

＊P＜0.05

皮質 海馬組別SAMR1 SAMP8 t Gαq/11 10.05±2.24 6.62±1.88 2.87＊Gαi 9.83±3.91 6.83±2.42 1.15 Gαs 9.28±2.40 7.39±1.58 1.62 Gαq/11 9.40±0.62 7.27±1.73 2.84＊Gαi 10.58±2.61 6.08±2.34 3.15＊Gαs 9.27±2.16 7.40±2.58 1.36

3 討論

既往大多數研究者普遍采用AD患者死后尸檢腦組織作為研究對象，并分別選取腦組織的不同部位對Gαq/11、Gαi和Gαs等的表達量和活性進行研究，但是由于尸檢組織來源有限，標本不新鮮和死因各異等缺陷，致使所得結果存在很大差異[4]。

而本研究采用SAMP8小鼠為研究對象，克服了上述研究的缺陷。SAMP8是一種自然發病、伴快速老化的AD模型鼠，它與人類衰老和癡呆的臨床特征比較接近，是一種較好的研究AD早期病理生理改變的動物模型[5]。在筆者前期的研究中，SAMP8在8月齡即出現了空間學習和記憶障礙，并隨增齡而病情加重[6]。本研究分別選取8月齡和18月齡SAMP8來研究AD發病早期和晚期時Gαq/11、Gαi和Gαs的表達量變化，結果表明，SAMP8在8月齡時皮質和海馬中Gαq/11、Gαi和Gαs的表達量并未發生明顯變化，這與AD早期體內對G蛋白信號的精細調節有關，使其不至于嚴重影響G蛋白下游信號分子和產物。小鼠SAMP8的平均壽命為16個月，到18個月時，小鼠SAMP8的各種生理功能都已進入終末階段。相對于同月齡正常對照SAMR1，SAMP8在18月齡時，皮質中的Gαq/11出現減低，海馬中的Gαi和Gαq/11均降低，而Gαs均無明顯變化。此結果部分與過去研究AD死后患者所得結果一致[7]。同時，在AD晚期，相對于皮質而言，海馬中Gαi和Gαq/11的表達量均出現明顯減低，這與海馬是學習記憶形成的關鍵部位、對外界損傷最敏感的部位有關。與腺苷酸環化酶途徑相比，AD中磷脂酰肌醇途徑受到的損傷相對更廣泛，最終通過PKC缺陷導致AD的發生[8]。筆者今后將進一步測定Gαq/11和Gαi下游信號分子的表達和活性，以期為AD的治療提供準確的作用靶點。

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