硒強化劑的急性和蓄積毒性試驗研究

胡 濱, 陳一資＊, 辜雪冬

(1.四川農業大學食品學院,雅安625014;2.西藏大學農牧學院,林芝860000)

硒是人體必需的微量元素之一,它具有清除體內自由基、提高免疫力以及拮抗重金屬等方面的生物學功能,它還與人類心血管疾病、生殖系統疾病以及骨關節疾病的發生具有相關性[1-2],因此作為一種保健食品原料已廣泛應用。但硒的安全劑量和中毒劑量之間的范圍相當狹小,一旦超出其安全劑量,就會引起人體的硒中毒[3-5]。本試驗旨在用保健食品常見的硒強化劑亞硒酸鈉對小鼠進行不同劑量灌胃,通過急性、蓄積性毒性試驗,建立小鼠硒中毒的動物模型,為硒的毒理學安全性評價積累資料。通過硒對小鼠生長性能變化、血常規、血液生化指標、主要器官組織病理學變化等進行系統綜合研究,了解高濃度硒的危害,防止由于硒攝入過量而對人造成毒害,為生產富硒保健食品和食品監督部門的安全監管提供可靠科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 清潔級昆明種小鼠180只,雌雄各半,體重20±2g,成都實驗動物中心提供。小鼠專用生長維持飼料:成都實驗動物中心提供。飼養溫度 22～25℃,濕度40%～60%,自然采光條件。

1.1.2 受試物 亞硒酸鈉(Na2SeO3·5H2O):分析純,含量>99%,成都市科龍化工試劑廠生產。

1.1.3 主要器材和試劑 全自動生化分析儀:7020型,日立電子公司生產;電子天平:TE412-L型,德國賽多利斯公司生產;超純水儀:Milli-Q型,美國密理博Millipore公司生產;硫酸,硝酸,高氯酸,鹽酸,氫氧化鉀,高錳酸鉀,乙醇等,均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗

1)預實驗 將亞硒酸鈉用超純水溶解后配成不同濃度溶液,再按小鼠體質量灌胃。取小鼠70只隨機分為7個組,每組10只,禁食14 h,不禁水,采用一次性灌胃給藥。用藥劑量分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/kg。灌胃后連續觀察 7 d[6]。

2)正式試驗 根據預備試驗所得最小致死劑量a=2.0 mg/kg,最大致死劑量b=8.0 mg/kg,則組間劑量比急性毒性正式實驗設置5個劑量組和1個對照組,每組10只,每組分別按 2.0、2.82、3.98、5.61、7.90 mg/kg 劑量一次性灌胃,對照組以超純水進行灌胃。灌胃后連續觀察7 d,觀察小鼠精神、食欲、飲水、活動并記錄小鼠中毒情況、死亡時間和死亡只數[6]。

1.2.2 蓄積性毒性實驗

1)動物的分組和給藥 采用20d蓄積性毒性試驗法來判斷硒對小鼠的蓄積毒性強度。設置4個試驗組和1個對照組,每組10只。試驗組分別按1/20、1/10、1/5、1/2 LD50劑量每日灌胃一次 ,對照組灌胃超純水,連續灌胃20 d。

2)檢查內容 觀察記錄各組小鼠的精神、活動、飲水、食欲等變化,并記錄死亡情況。在實驗第21天剖殺全部小鼠取血及主要臟器,系統研究亞硒酸鈉對小鼠臟器指數,剖解、組織病理變化,血常規、血液生化等的影響[6]。

1.3 數據統計

2 結果與分析

2.1 急性毒性實驗結果

試驗Ⅴ組、Ⅳ組小鼠在灌胃4 min后開始出現小鼠活動減少,嗜睡,乏力,反應遲鈍等狀況。隨后精神極度沉郁,站立不穩,呼吸困難,全身抽搐后死亡。隨著時間延長其他組小鼠陸續出現類似情況。各組小鼠死亡情況如表1所示。根據改良寇氏法算得:LD50=3.86 mg/kg;LD5095%的可信區間為3.82～3.90 mg/kg。

表1 急性毒性試驗小鼠死亡結果Tab.1 Results of mice died oin acute toxicity experiments

2.2 蓄積性毒性實驗結果

2.2.1 臨床觀察 對照組和Ⅰ組小鼠在試驗期間食欲正常,精神良好,個體增重迅速,未出現死亡現象;Ⅱ組和Ⅲ組小鼠在試驗初期,個別小鼠精神不佳,部分小鼠皮膚變得松弛,被毛凌亂,食欲減損,未出現死亡現象;Ⅳ組小鼠灌胃后也有不適現象,隨著染硒時間延長,出現食欲減損、行動遲緩、被毛凌亂,體重下降等狀況,并在第17 d,19 d分別死亡小鼠1只。各組體重變化情況如表2所示。

由表2知,試驗開始時,各組小鼠平均體重差異不顯著(P>0.05)。在試驗第7d,對照組與Ⅰ組、Ⅱ組差異不顯著(P>0.05);對照組與Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)。在試驗第14d,對照組與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05);對照組與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05),Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組之間差異不顯著(P>0.05)。在試驗第21d,對照組與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05),對照組與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著或極顯著(P<0.01)。

整個試驗階段所有組別小鼠平均體重都隨時間在一直增長,但不同染毒組隨染毒劑量增大及染毒時間的延長,平均體重增幅逐漸減小。在初始體重差別極小情況下,Ⅲ組、Ⅳ組小鼠在整個實驗階段體重增幅明顯低于對照組,說明對小鼠灌胃0.77 mg/kg和1.93 mg/kg劑量的硒有阻礙生長的作用。其原因可能是隨著硒攝入量的增加對小鼠產生毒性作用,干擾了小鼠正常生理代謝,故降低了體重增幅。此外,Ⅳ組小鼠在試驗期間出現死亡,可能也是引起該組小鼠平均體重增幅降低的原因之一[7]。

表2 各組小鼠平均體重的測定結果Tab.2 Average body weight(g)of different groups (單位:g)

2.2.2 病理剖解變化 剖檢中毒死亡小鼠發現其皮毛松弛,凌亂;心臟有不同程度的腫脹,胸腔出現充血;肝臟明顯腫大,色澤變黑,肝表面有明顯顆粒狀物質;腎臟出現腫大;脾臟出現腫大現象。死亡小鼠胃腸道肉眼觀察未見異常。

2.2.3 組織病理學變化 肝臟:Ⅰ組無明顯變化,Ⅱ組和Ⅲ組出現有顆粒變性以及輕微的間質增寬現象,Ⅳ組出現細胞濁腫,胞漿疏松,有顆粒變性和空泡變性。脾臟:Ⅰ組未見有病變;Ⅱ組和Ⅲ組在脾髓內充滿血液,紅髓的脾竇有充血現象;Ⅳ組脾髓充血,白髓縮小、出血。腎臟:Ⅰ、Ⅱ組腎臟都未見異常;Ⅲ組、Ⅳ組有腎小球體積增大,間質小血管擴張淤血,腎小管上皮細胞胞漿嗜酸性增強,有顆粒變性等現象;心臟:第Ⅳ組心肌纖維部分腫脹,斷裂,有顆粒變性;其他組織鏡下未見異常變化。

2.2.4 臟器指數

本實驗的臟器指數如表3所示。

表3 不同硒水平對小鼠臟器指數的影響Tab.3 Effect of selenium level on the mice viscera index

由表3知,心臟指數:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組與對照組差異不顯著(P>0.05),Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05),Ⅳ組與對照組差異顯著(P<0.05)。這與病理解剖觀察到死亡小鼠心臟腫大相一致,說明攝入高劑量硒會引起小鼠心臟腫大,胸腔充血[9]。肝臟指數:Ⅰ組與對照組差異不顯著(P>0.05),Ⅱ組和Ⅲ組與對照組差異顯著(P<0.05),Ⅳ組與對照組差異極顯著(P<0.01)。這與病理解剖觀察到死亡小鼠肝臟腫大相一致[10-11]。脾臟指數:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組與對照組差異不顯著(P>0.05),Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05),Ⅳ組與對照組差異顯著(P<0.05),這與病理剖解觀察到死亡小鼠脾臟腫大相一致[12]。腎臟指數:Ⅰ組與對照組差異不顯著(P>0.05);對照組與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。說明灌胃0.386 mg/kg硒時,可能會引起小鼠腎臟的損害,造成腎臟腫大。這與病理組織學觀察結果相一致。肺臟指數:4個染硒組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

2.2.5 血常規檢測 本實驗的臟器指數如表4所示。

由表4知,對照組的各項血常規指標與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05),與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01);Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組之間的 WBC、RBC、Hb、PCV、N、L 差異顯著(P<0.05),詳情見表4。

實驗Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的紅細胞數(RBC)、血紅蛋白含量(Hb)、血小板數(PL T)、紅細胞壓積(PCV)均顯著下降,可能是由于硒攝入過量后影響了骨髓造血機能,導致紅細胞生成減少,血小板生成障礙,以致血紅蛋白量、紅細胞壓積降低。實驗Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的白細胞數(WBC)、中性粒細胞數(N)均不同程度下降,原因可能是脾臟發生病變引起。脾臟是體內重要的免疫器官,與機體免疫功能關系密切。病理切片觀察紅髓內細胞成分減少,白髓縮小,說明脾臟遭到損傷;白細胞又是體內的免疫細胞,中性粒細胞在白細胞總數中所占比例較大,隨著硒攝入量增加,對機體免疫功能產生一定抑制作用,造成二者數量都下降[11];實驗Ⅰ組的淋巴細胞(L)數量略高于對照組,而Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的顯著低于對照組,由于淋巴細胞數量直接反應機體免疫功能高低,在實驗中的Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組淋巴細胞數量下降,說明隨著硒的攝入劑量增加,可能對小鼠的免疫系統功能產生了抑制作用。

2.2.6 血液生化指標檢測 本試驗血液生化檢測指標結果見表5。

表4 不同硒水平的小鼠血常規測定結果(n=5)Tab.4 Effect of selenium level on the mice viscera index at different group(n=5)

由表 5知,對照組的總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、A/G值與第Ⅰ組差異不顯著(P>0.05),而對照組的 TP、ALB、A/G值與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01),各組的球蛋白(GLO)都差異不顯著(P>0.05)。第Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的 TP、ALB、A/G值都不同程度降低,可能是硒攝入過量后對肝臟造成損傷,使肝臟合成蛋白質的能力下降,導致總蛋白和血清蛋白含量降低,A/G值下降也提示動物肝功能可能受損。這與病理組織觀察到Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組肝臟病變相一致。對照組的谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(AL T)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(A KP)均與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05),與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的AST、AL T、A KP活性與對照組差異顯著或極顯著,可能是小鼠肝細胞變性壞死后,AST、ATL、A KP從受損的肝細胞中大量逸出,造成其在血清中活性明顯升高;正常情況下血清中AST活性很低,心臟的活性很高,當硒攝入過量引起心肌纖維斷裂,細胞膜通透性增高,AST大量釋放入血,可能也是造成血清中活性明顯升高的原因;當腎小管上皮細胞受損也可釋放A KP,導致血清A KP活性升高。LDH也可作為判斷心臟或肝臟發生病變的指標。LDH增高可能是隨著攝入硒的劑量增加對小鼠肝臟造成損壞而引起,也可能是由于小鼠心臟腫大受損而引起。這與解剖學及組織病理學觀察到肝臟、腎臟、心臟發生病變相一致。各組的甲胎蛋白和癌胚抗原都呈陰性,說明各組小鼠的肝臟都未發生致癌變化。

3 結 語

1)由急性毒性實驗所得小鼠經口LD50為3.86 mg/kg,按中國毒理學經口急性毒性評判標準為劇毒物質,小鼠發生急性硒中毒的主要靶器官是肝臟和心臟。但由于低劑量的硒對動物生長有促進作用,因此在保健食品中添加亞硒酸鈉時務必控制其用量,避免人體發生急性中毒。

2)蓄積性毒性實驗表明亞硒酸鈉屬于弱蓄積性物質,小鼠發生硒蓄積性中毒的主要靶器官是肝臟、心臟、脾臟和腎臟。當染硒劑量為0.39、0.77、1.93 mg/kg時,3個組小鼠體質量增長緩慢,生長發育受阻。隨染硒劑量的增高,小鼠生長受阻現象越嚴重。當染硒劑量為0.19 mg/kg時,對小鼠有一定促生長作用,即低劑量的硒有助于動物生長發育[13-14]。

硒雖然是人不可缺少的微量元素,但不能攝入過量,否則會對機體帶來急性和蓄積性損害作用。在補硒食品的生產過程中,為了保障人們食品安全,不應盲目增加食品中硒的添加劑量,硒的添加劑量要控制在人體的安全攝入量范圍之內,要保證高硒地區不致發生硒中毒,低硒或缺硒地區居民滿足生理和最低需要量。

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