十味膽寧膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉豐林,張進(jìn)朝,胡素英

(1.開封市中醫(yī)院,河南開封 475001;2.開封市第二中醫(yī)院,河南開封 475001)

十味膽寧膠囊由金錢草、黃芩、黃連、柴胡、玄明粉、羚羊角粉、甘草、甘姜等十味中藥組成,功效為清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié),主要用于膽結(jié)石、膽囊炎的治療,是開封市中醫(yī)院獲得河南省食品藥品監(jiān)督管理局制劑批文的院內(nèi)制劑(豫藥制字Z04020115),臨床療效確切。以其所立的市級(jí)課題“膽寧膠囊治療膽石癥臨床研究”于 1996年獲開封市科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎(jiǎng)。但十味膽寧膠囊存在服用量大的缺陷,其生產(chǎn)工藝需要進(jìn)行改革,由于原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)鑒別和含量測(cè)定項(xiàng),因此不能滿足生產(chǎn)工藝改革后的質(zhì)量控制。為了更有效地控制其質(zhì)量,提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),參考 2005版《中國(guó)藥典》(一部),對(duì)方中主要藥味金錢草、黃芩、柴胡擬定了薄層鑒別,同時(shí)用高效液相色譜法對(duì)金錢草中所含的槲皮素、山奈素進(jìn)行了含量測(cè)定,以期為該制劑的新生產(chǎn)工藝提供質(zhì)量控制依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 藥材及對(duì)照品

十味膽寧膠囊,根據(jù)處方由開封市中醫(yī)院制劑室自制,批號(hào) 080507,080812,090309。對(duì)照品:槲皮素 (110766-200816)、山奈素 (110766-200816)、柴胡皂苷a對(duì)照品 (110766-200816)、柴胡皂苷d對(duì)照品(10766-200816)、柴胡對(duì)照藥材(110766-200816)、黃芩苷對(duì)照品 (110737-200812)、黃芩對(duì)照藥材(110766-200816),均購(gòu)買自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與試劑

日本島津高效液相色譜儀,包括島津 LC-10ATvp泵、SPD-10Avp型紫外檢測(cè)器CTO-10Avp型柱溫箱及CBM-2Avp型色譜工作站,均為島津儀器(蘇州)有限公司產(chǎn)品。AS3120A超聲清洗儀,天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品。薄層層析展開槽,開封百紡化玻有限公司提供。硅膠薄層板:羧甲基纖維素鈉、硅膠 G薄層板(5 cm× 10 cm),購(gòu)自青島海洋化工集團(tuán)公司。甲醇(一級(jí)色譜純),天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品,產(chǎn)品批號(hào) 090822;其余試劑均為分析純,為天津化學(xué)試劑六廠產(chǎn)品。

2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.1 薄層鑒別

2.1.1 柴胡的TCL鑒別

取本品8粒,加甲醇20 mL,超聲處理10 min,濾過(guò),濾液濃縮至 5m L,濾過(guò),濾液作為供試品溶液。另取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對(duì)照品,加甲醇制成每1毫升各含0.5 mg的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn),吸取上述兩種溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,以醋酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以 2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,60℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,分別置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)或黃色熒光斑點(diǎn)。

2.1.2 黃芩的TCL鑒別

取本品6粒,加甲醇20 mL,超聲處理20 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?mL使溶解,作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材 1 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。再取黃芩苷對(duì)照品,加甲醇制成每 1毫升含1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn),吸取上述 3種溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一以含 4%醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠 G薄層板上,以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑,預(yù)平衡30min,展開,取出,晾干,噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn);在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯一相同的暗綠色斑點(diǎn)。

2.1.3 金錢草的TCL鑒別

取本品6粒,加80%甲醇20mL,超聲處理20min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)铀?0mL使溶解,用乙醚提取2次,每次10mL,棄去乙醚液,水液加稀鹽酸10mL使溶解,水浴加熱1h,迅速冷卻,用乙酸乙酯提取2次,每次10mL,合并乙酸乙酯液,用水30mL洗滌,棄去水洗液,乙酸乙酯液蒸干,殘?jiān)蛹状?mL使溶解,作為供試品溶液。另取槲皮素、山奈素對(duì)照品,加甲醇制成每1毫升含0.5mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn),吸取上述供試品溶液5μL,對(duì)照品溶液各2μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以 3%三氯化鋁乙醇溶液。在105℃下加熱5min,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯一相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠;流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)),0.45μm微孔濾膜濾過(guò),用前超聲脫氣;檢測(cè)波長(zhǎng)為 360 nm;柱溫30℃;流速1.0m L/min。

在此色譜條件下,測(cè)得槲皮素、山奈素對(duì)照品貯備液和供試品溶液色譜圖。可見槲皮素峰的保留時(shí)間約為20.2 min(見圖1),山柰素峰的保留時(shí)間約為36.1min(見圖2);兩峰與相鄰峰分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)分別為 3 700和 6 229。

圖1 槲皮素對(duì)照品色譜圖

圖2 山柰素對(duì)照品色譜圖

3.2 對(duì)照品溶液的制備

參照文獻(xiàn)[1],精密稱取槲皮素對(duì)照品及山柰素對(duì)照品適量,加 80%甲醇制成為每 1毫升各含槲皮素3.89μg、山柰素19.45μg的溶液。

3.3 供試品溶液的制備

參照文獻(xiàn)[1],取本品 5粒內(nèi)容物,混勻,研細(xì),過(guò)3號(hào)篩,精密稱取 2 g,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇50mL,密塞,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,用 80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液25 mL,精密加入鹽酸5mL,置90℃水浴中加熱水解 1 h,取出,迅速冷卻,轉(zhuǎn)移至50m L量瓶中,用 80%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

3.4 陰性對(duì)照品溶液的制備

取缺金錢草的模擬制劑等量,按供試品溶液的制備方法制備。

3.5 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測(cè)定,以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算。

3.6 線性關(guān)系考察

精密吸取濃度為3.89μg/mL的槲皮素對(duì)照品溶液 4,8,12,16,20μL,注入液相色譜儀,測(cè)定峰面積積分值,以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,方程為:Y=1.36×103X+20.655。精密吸取濃度為 19.45μg/m L的山柰素對(duì)照品溶液,同法測(cè)定,得方程為:Y=31.8×103X+15.72。結(jié)果表明:槲皮素在6～80μg間,濃度與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系;山柰素在 10.8～154.4μg間,濃度與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

3.7 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液 10μL,重復(fù)進(jìn)樣5次,按上述色譜條件測(cè)定,槲皮素和山柰素峰面積積分值的RSD分別為0.60%和0.91%,見表1和表2。

表1 槲皮素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 山柰素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)的供試品溶液(批號(hào) 080507),每隔2 h進(jìn)樣1次(10μL),共進(jìn)樣6次,按上述色譜條件分別測(cè)定。結(jié)果槲皮素和山柰素的RSD,分別為1.64%和1.23%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品5份(批號(hào) 080507),按供試品溶液制備方法分別制備供試品溶液(n=5),照3.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定結(jié)果,槲皮素平均含量為46.68μg,RSD為 0.63%;山柰素平均含量為31.12μg,RSD為1.20%。

3.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號(hào)080507)內(nèi)容物適量,精密稱定,分別精密加入槲皮素對(duì)照品溶液(3.89μg/mL)30.0 mL和山奈素對(duì)照品溶液(19.45μg/mL)4.0 mL,按照供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備,依法測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果見表 3～4。

表3 槲皮素回收率測(cè)定結(jié)果

表4 山柰素回收率測(cè)定結(jié)果

3.11 樣品含量測(cè)定

取 3批樣品,按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定,槲皮素、山柰素含量測(cè)定結(jié)果見表 5。

表5 3批樣品槲皮素含量測(cè)定結(jié)果

表6 3批樣品山柰素含量測(cè)定結(jié)果

3.12 空白實(shí)驗(yàn)

取處方量除金錢草外其余各藥味,制成陰性樣品,按含量測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明:陰性樣品的HPLC圖譜中,未呈現(xiàn)與金錢草對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰,表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖 3和圖 4。

4 討 論

十味膽寧膠囊薄層色譜鑒別均作了陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:各薄層斑點(diǎn)不受樣品中的其他藥的干擾。專屬性強(qiáng),簡(jiǎn)單易行,可作為本品定性檢測(cè)的指標(biāo)。

金錢草為十味膽寧膠囊組方中君藥,具有清利濕熱、清肝利膽、退黃的作用,將其所含槲皮素、山柰素作為定量指標(biāo)對(duì)其制劑質(zhì)量的控制具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)樣品溶液的制備是參照2005年版《中國(guó)藥典》(一部)金錢草含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液制備的方法,因本樣品為片劑,故回流 1 h,經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明該法提取效果較好,干擾成分較少。

實(shí)驗(yàn)中以文獻(xiàn)[1]提供的色譜條件為基礎(chǔ),通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索,制劑中各組分能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離,證明該條件適合該制劑的含量測(cè)定。

本文建立的方法簡(jiǎn)便,專屬性及重復(fù)好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于該制劑的質(zhì)量控制與分析。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:198,152,331-332.