百合種質資源間親緣關系及RAPD指紋圖譜分析

童巧珍，周日寶，劉湘丹，盛孝邦，王朝暉

（1.湖南農業大學，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

百合，作為藥用植物、觀賞植物和食物在中國的栽培已經有很長一段歷史，其種質資源豐富，常見有以下種或品種。

藥用百合有百合科植物卷丹 Lilium lancifolium Thunb.、百合L.brownii F.E.Brown var.viridulum Baker、細葉百合L.pumilum DC.的干燥肉質鱗葉[1]；觀賞百合在商業花卉栽培學上其主要分為以下三大類型：一是東方百合 （Oriental hybrids）種群類型；二是亞洲百合 （Asiatic hybrids）種群類型；三是麝香百合（L.longiflorum）種群類型[2]。至今在切花栽培中仍負盛名的“康涅鍬格王子”就是卷丹、毛百合（L.dauricum Ker.Gawl）與荷蘭百合（L. enchantment）雜交所獲得的中世紀百合雜交種中的優良品種，王百合（L.regale）、麝香百合亦為名貴切花[3]；食用百合主要有百合、卷丹、川百合（L.davidii Duch.）、山丹（L.pumilum DC.）、百合、毛百合及沙紫百合（L.sargentiae Wils.）。

中國作為中藥資源大國，盡管種質資源豐富，但由于種種原因，一些野生資源遭到嚴重破壞。盡管自20世紀80年代以來我國對百合屬植物的研究己取得了一些初步成果，但從現有資料分析中可看出，有關百合的研究工作主要集中在分類學、繁殖及栽培生物學、細胞學、育種等4個方面，對其種質資源描述評價方面卻少有涉及[4-5]。而對百合種質資源及其親緣關系的研究，可為其栽培生產提供適宜的種類，為其育種提供豐富的種源，從而對百合產業的可持續發展有著重要意義。筆者利用RAPD技術對不同來源的百合種質資源進行了研究，其DNA提取及RAPD條件優化方法均已作了報道[6-7]，現將其種質資源間親緣關系及RAPD指紋圖譜分析方法與結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 百合種源概況

2005年7～11月從江蘇、江西、廣西、湖南、甘肅5省（區）采集16個百合種質資源各10～16株（表1），種植于湖南中醫藥大學藥用植物園內，以備采集新鮮鱗葉和其他試驗用。每一產地來源的百合樣品采集10株地下新鮮肉質鱗葉，分別提取其DNA，然后按照等量方式將來自10株的DNA混合后，作為該地百合DNA的樣本，用于RAPD分析。

表1 百合樣品來源一覽表

1.2 DNA提取及RAPD擴增反應

參見文獻[6-8]中DNA提取及RAPD擴增反應條件優化的方法。

1.3 數據分析

將電泳圖譜上清晰且可重復出現的條帶賦值為“1”，同一位置無帶的賦值為“0”，由此生成“0”和“1”原始矩陣。統計每個引物擴增處的總帶數和多態性帶數。數據采用NTSYS軟件進行UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）聚類分析，建立樣品間的親緣關系聚類樹型圖。

2 結果與分析

2.1 RAPD隨機擴增多態DNA標記引物篩選與PCR擴增結果

本法提取的百合基因組DNA的樣品，測得其OD260/ OD280比值范圍為1.53～2.00，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，提取的基因組DNA為一條清晰完整明亮的帶，遷移率與λDNA相當，沒有拖尾或彌散現象(圖1)。凝膠的點樣槽中未發現明顯的熒光信號。因而，該實驗提取的DNA純度高，完全符合實驗的要求，可用于進一步進行RAPD擴增。

隨機用5號樣品對120條隨機引物進行篩選，從中選出35條能獲得清晰譜帶、反應穩定、存在多態性和重復性好的引物用于PCR擴增和群體遺傳變異的分析(表2，圖1)。

2.2 百合供試材料基因組的指紋圖譜分析

利用引物B2、G4、M14、B3對16份百合供試材料進行RAPD擴增產物電泳圖分析，得出各樣品相對應引物擴增產物的DNA指紋圖譜及指紋峰（表3）。結果表明指紋圖譜能反應出樣品間差異，可為鑒別藥材提供分子水平指紋圖譜。圖2為11號樣品的DNA指紋圖譜，圖3為B2、G4、M14、B3擴增產物電泳圖譜的三維圖譜。

圖1 引物M19擴增結果圖

表2 百合種質資源35條有效引物序列及其DNA片段數

表3 引物B2、G4、M14、B3對各樣品擴增的指紋峰

圖2 引物B2、G4、M14、B3對樣品11擴增的指紋圖譜

圖3 引物B2、G4、M14、B3擴增產物電泳圖譜三維圖譜

2.3 百合供試材料的親緣關系及遺傳距離分析

RAPD擴增結果表明，35條有效引物共擴增出769條譜帶，其中多態帶有628條，多態性位點比率為81.7%，每條引物擴增的帶數在11～36條之間，平均為22條。其中擴增帶數最多的為B1引物，有36條擴增帶，且不同的引物擴增片段的數目及其多態性程度不同，表明供試材料具備豐富的遺傳多樣性。利用統計分析軟件將16份不同百合種質資源的RAPD標記進行聚類分析(圖4)，參照表4列出的不同百合種質資源間的遺傳距離可看出，16份樣品之間的遺傳距離為0～0.940 7。其中，樣品6與樣品7之間的遺傳距離最小達到0.008 9，兩者間親緣關系最近，為卷丹從江蘇省引種到湖南省龍山縣栽培過程中形成的2個農家品系（尖頭系和平頭系）。樣品10與樣品11之間的遺傳距離最大為2.209 1，表明這兩個樣品間有較大的遺傳背景差異，它們之間的親緣關系最遠，為百合科兩個近緣百合屬和大百合屬植物。

在聚類分析的基礎上，16份供試品以遺傳距離0.940 7為閾值可分為2個RAPD群（RAPD groups，簡稱RGs），即RG1和RG2。其中RG2為樣品10，而其他樣品為RG1。這為百合科的不同兩個屬，RG1為百合屬 （lilium），RG2為大百合屬（cardiocrinum）。

RG1在閾值為0.579 0處又被分為兩大亞群：第一大亞群包括樣品6、7、11、12，其余樣品為第二大亞群。第一大亞群在閾值為0.316 7處又被分為兩類：一類為6、7、12號樣品卷丹L.lancifolium Thunb.；第二類為11號樣品細葉百合L.pumilum DC.。第二大亞群在閾值為0.298 2樣品分為兩類，第一小類為野生種樣品4，除10號樣品外，其余為第二小類，均為栽培品種，說明同屬同種植物因為生存環境不同，存在著較大的遺傳差異。聚類結果與生長環境亦有趨異效應，故第二小類同屬同種不同產地的百合存在較小的分類。以上聚類分析結果與傳統鑒別的結論一致，說明RAPD分析可以從分子水平上鑒定不同屬不同種不同遺傳背景的藥材，為中藥材百合種質資源的研究和利用提供了一種新的方法。

表4 百合樣品間遺傳距離

圖4 基于RAPD標記結果的實驗材料聚類分析圖

3 討論

3.1 指紋圖譜及三維圖譜分析

應用凝膠成像分析系統對RAPD擴增產物電泳圖進行分析可以得出以泳道中各譜帶的吸收度值A為縱坐標、譜帶位置Pix為橫坐標的指紋圖譜及三維圖譜。從圖譜中可以看出不同樣品同一引物擴增產物指紋圖譜峰有相同位置，也存在不同位置，能體現不同樣品之間基因組序列存在的差異，說明不同樣品基因組序列中與引物互補的相同序列片斷位點不同。不同樣品同一譜帶位置峰峰高（吸收度值）不同，說明不同樣品基因組序列中與引物相互補的相同序列片斷數目不同。指紋圖譜和電泳圖譜都能說明樣品之間的遺傳背景差異，但指紋圖譜將擴增產物電泳條帶的有無及條帶的強弱轉化為指紋峰形式，這可與化學指紋圖譜一起建立鑒別中藥材優良種質的多元鑒別體系，具有較大的研究意義。

3.2 遺傳距離和聚類分析

從分析結果可知不同屬百合之間遺傳距離較大，親緣關系較遠，同屬百合之間遺傳距離相對較小，親緣關系較近，但屬內不同種百合之間亦存在一定的遺傳距離，證明種內亦存在遺傳差異；另同屬同種植物之間也存在一定的遺傳距離，這說明地域差異也會引起植物產生趨異效應而具遺傳差異；野生種與經過馴化的栽培品種在遺傳距離也較大，表明野生種與栽培種在遺傳背景上存在一定的差異；藥材具有明顯的地域性，地域上偏北或偏南的同屬同種植物之間遺傳距離相對較小，而地域偏北與偏南的同屬同種植物之間遺傳距離相對較大。

通過對16個樣品進行ΜPGMA聚類分析得到樹狀圖表明所研究的百合品種分為兩大類群，繼而又將一些亞群明顯區分開來。實驗結果與我們經驗鑒定的結果一致，說明RAPD技術具有較高的分辨力，完全能夠將在形態、生藥性狀及化學成分等特征上具有高度相似性、來源一致或十分相近的藥材區別開來，可正確鑒別百合科不同屬及種間群體。而且對種內等級亦能進行有效的區別，為百合藥材的鑒定、百合不同品系的鑒定以及篩選優良品系提供分子生物學依據。RAPD分子遺傳標記的應用，從居群和分子水平上闡明藥材道地性產生的生物學本質成為可能，因而該方法可以作為不同中藥百合品系鑒定的依據，為中藥百合的鑒定提供了一種行之有效的分子水平方法。

[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫藥科技出版社,2005:88.

[2]神農氏.神農本草經[M].北京:人民衛生出版社,1982:67.

[3]蘇 敬,李 績.唐本草[M].合肥:安徽科技出版社,1981:223-224.

[4]盧之頤.本草乘雅半偈[M].北京:人民衛生出版社,1986:279-280.

[5]李時珍.本草綱目[M].北京:人民衛生出版社,1982:1 680-1 682.

[6]童巧珍，周日寶，劉湘丹，等.藥用百合鱗葉中總DNA提取方法的研究[J].中國藥房，2008，19（6）：406-408.

[7]童巧珍，盛孝邦，劉湘丹，等.藥用百合DNA提取和RAPD條件的優化[J].湖南中醫藥大學學報，2008，28（2）：33-36.

[8]易慶平,羅正榮,張青林.植物總基因組DNA提取方法綜述[J].安徽農業科學,2007,35(25):7 789-7 791.