尿液蛋白質(zhì)分離檢測(cè)及臨床意義的研究進(jìn)展

王洪禮，寧 莉 綜述，魏殿軍 審校

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211）

尿液蛋白檢測(cè)及特性的鑒定對(duì)評(píng)價(jià)泌尿系統(tǒng)的功能和疾病非常重要。尿蛋白含量的檢測(cè)方法很多，因檢測(cè)方法和技術(shù)特性不同，其對(duì)尿蛋白的敏感性和特異性也不同。以往采用免疫化學(xué)方法檢測(cè)尿微量白蛋白（mAlb）對(duì)腎臟損害作評(píng)價(jià)較尿常規(guī)、腎功能檢查敏感，已被臨床醫(yī)生接受[1]。近來國(guó)外有報(bào)道發(fā)現(xiàn)用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定尿中非免疫活性白蛋白（INUA）能更早期地提示糖尿病腎臟損害，而采用常規(guī)免疫化學(xué)法不能測(cè)定之。因此，現(xiàn)階段如何更好地分離和篩選尿蛋白檢測(cè)指標(biāo)對(duì)臨床相關(guān)疾病的診斷具有非常重要的意義[2]。

1 尿液蛋白質(zhì)的分類和臨床特性

尿液中的蛋白質(zhì)是非常復(fù)雜的，它們以多種形式存在。傳統(tǒng)意義上，根據(jù)蛋白分子量的不同，將尿蛋白分為小分子蛋白（β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白）、中分子蛋白（白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白）、大分子蛋白（IgG、IgA、IgM、α2－巨球蛋白）。近年來，根據(jù)尿白蛋白的免疫活性又將其分為有免疫反應(yīng)活性的白蛋白和非免疫活性白蛋白兩類。而利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法可鑒定出來的尿蛋白質(zhì)有171個(gè)，這包括5個(gè)男性特異性蛋白質(zhì)——前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶前體、前列腺分化因子、精子形成蛋白Ⅰ和精子形成蛋白Ⅱ的前體，同時(shí)還鑒定出12個(gè)低分子量蛋白質(zhì)（<10 kDa）。蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定出來的尿蛋白質(zhì)大部分分子量范圍為30~60 kDa，等電點(diǎn)范圍為4~10[3]。

臨床上最常用的尿液蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法是免疫比濁法(RIA)。近年來發(fā)現(xiàn)HPLC法測(cè)定的白蛋白總量遠(yuǎn)超過RIA法測(cè)定的白蛋白濃度，因而推斷有大量其他形式的白蛋白存在，其中包括非免疫活性白蛋白。非免疫活性白蛋白也是人體白蛋白成分，在尿液中大量存在，其分子與人血清白蛋白的大小相同，利用傳統(tǒng)的抗人血清白蛋白抗體法不能檢測(cè)出來。它們由多肽鏈組成，可被蛋白酶水解，其間通過二硫鍵和非共價(jià)鍵連接。這些白蛋白很可能是在通過腎臟的過程中形成，但也不排除血中含有少量該物質(zhì)并被腎臟清除。研究表明，糖尿病人由無蛋白尿進(jìn)展至微量蛋白尿期，尿中非免疫活性蛋白水平逐漸增高。Osicka等[4]對(duì)糖尿病人尿液非免疫活性白蛋白檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)該指標(biāo)可將1和2型糖尿病人出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿的危險(xiǎn)性預(yù)測(cè)分別提前3.9年和2.4年。

2 尿液蛋白質(zhì)分離技術(shù)

尿液蛋白質(zhì)分離通常采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳，此外用于蛋白質(zhì)組分離的技術(shù)還有二維層析、熒光差異顯示雙向電泳、二維液相分離和同位素親和標(biāo)記等方法。

2.1 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（2-DE） 是使用最廣泛的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，具有很高的分辨率，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究中的核心技術(shù)之一。其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量的差異使之在二維平面上分開。目前，最多可分離到11 000個(gè)左右蛋白樣點(diǎn)。盡管雙向電泳技術(shù)近幾年已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，是當(dāng)前蛋白質(zhì)分離的最常用技術(shù)，但其本身還有一些難以克服的問題[5-6]。

2.2 毛細(xì)管電泳（CE） 其中應(yīng)用較為廣泛的是毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）（依據(jù)不同蛋白質(zhì)的電荷質(zhì)量比的差異實(shí)現(xiàn)分離）、毛細(xì)管等電聚焦（依據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同在毛細(xì)管內(nèi)形成pH梯度而實(shí)現(xiàn)分離）和毛細(xì)管電色譜（毛細(xì)管電泳和液相色譜的融合技術(shù)）。CE具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、分離自動(dòng)化和成本消耗少等優(yōu)點(diǎn)。毛細(xì)管電色譜是近年發(fā)展起來的一種新型微分離分析技術(shù)，它整合了毛細(xì)管電泳與微徑柱液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，通過在填充微細(xì)顆粒液相色譜填料的微徑柱色譜柱兩端施加直流高壓電場(chǎng)，達(dá)到其對(duì)痕量復(fù)雜生物及化學(xué)體系樣品優(yōu)越的分離能力。

2.3 二維色譜技術(shù) 二維色譜分離蛋白質(zhì)有多種組合模式，第一維色譜多為離子交換色譜，也有凝膠過濾色譜，第二維通常是反相色譜，反相色譜采用反相有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，從而避免了鹽等添加劑對(duì)后續(xù)質(zhì)譜分析的影響。這種技術(shù)最大優(yōu)勢(shì)是可以避開相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)的限制。作為一種新的技術(shù)，它的主要問題是分辨率和重現(xiàn)性尚不能與二維凝膠電泳相比。

3 尿蛋白檢測(cè)的幾種方法

由于總蛋白測(cè)定無法區(qū)分腎小球和腎小管型蛋白尿，Ellis和Buffone建議通過測(cè)定不同性質(zhì)的尿白蛋白來確定腎小球來源的病理性。尿白蛋白檢測(cè)包括傳統(tǒng)的磺基水楊酸法、加熱乙酸法、沉淀法、比濁法等。這些方法測(cè)定尿白蛋白具有一定局限性，如溴酚藍(lán)作為染料結(jié)合劑測(cè)定尿白蛋白時(shí)穩(wěn)定性差，即便在30 s內(nèi)完成比色，受球蛋白的干擾仍較大；常規(guī)應(yīng)用的免疫比濁法在測(cè)定<6mg/L的尿液白蛋白時(shí)不夠敏感。理想的測(cè)量腎臟排泄蛋白質(zhì)的選擇能力時(shí)，應(yīng)該用分子大小很不一致的蛋白質(zhì)。散射免疫比濁法與免疫電泳技術(shù)已常用于尿液中各種蛋白質(zhì)的定量；聚丙烯酰胺凝膠電泳可測(cè)量分子大小不一的蛋白質(zhì)的大致比例；放射免疫試驗(yàn)用于尿液中白蛋白、IgG、β2-微球蛋白的定量測(cè)定；濁度法可測(cè)定尿液中各種血漿蛋白質(zhì)。除常用方法外，本文再具體分析幾種檢測(cè)尿液蛋白質(zhì)的新方法。

3.1 HPLC HPLC法測(cè)定尿液蛋白質(zhì)具有高效和高的重現(xiàn)性，分析時(shí)間短，親水的二醇鍵合相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的良好回收率。使用寬的pH范圍（pH3~8）色譜柱與流動(dòng)相中有機(jī)改性劑和變性劑相兼容，消除了蛋白質(zhì)的聚合，從而實(shí)現(xiàn)正確的蛋白質(zhì)分子量測(cè)定。用于包括蛋白質(zhì)單體、二聚體和聚合體的分離、脫鹽、蛋白質(zhì)分子量估算和改性蛋白質(zhì)的分離。而新的HPLC檢測(cè)方法比RIA法對(duì)早期高危病人的預(yù)測(cè)更可行、更敏感[7]。HPLC可檢測(cè)尿液中免疫活性和非免疫活性蛋白質(zhì)，檢測(cè)出微量蛋白尿以下的尿蛋白水平，而常規(guī)檢測(cè)方法不利于合并其他心血管疾病和代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)。

3.2 CZE CZE具有高效、快速、微量、多模式、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化及潔凈等優(yōu)點(diǎn)，是一種快速、高分辨、高靈敏的尿蛋白質(zhì)檢測(cè)方法[8]。堿性緩沖液中（pH=9.0）各種蛋白質(zhì)都帶負(fù)電,向陽(yáng)極泳動(dòng)。但在強(qiáng)力的電滲流的作用下，實(shí)際電泳中向陰極泳動(dòng)。通過紫外檢測(cè)器檢測(cè)信號(hào)，最終將其制成電泳圖譜。根據(jù)圖譜中峰面積換算成蛋白含量。本法可在8min內(nèi)將尿蛋白電泳分離，其中兩個(gè)主要的峰1號(hào)峰為肌酐峰，3號(hào)峰為尿白蛋白峰。但毛細(xì)管電泳儀進(jìn)樣時(shí)精度較HPLC低，定量分析時(shí)以用內(nèi)標(biāo)法為宜[9]。

3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展主要依賴于高通量分離和分析技術(shù)的突破性進(jìn)步。首先是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的日益完善，使得蛋白質(zhì)的高通量分析成為可能。其次是質(zhì)譜技術(shù)，現(xiàn)已成為檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的重要手段。最后是生物信息學(xué)的建立使得國(guó)際性的科學(xué)大協(xié)作得以形成。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)一步深入，將對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展起到重要的推動(dòng)作用。尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)于研究器官功能，尤其是腎臟和泌尿道功能具有重要意義。目前對(duì)尿蛋白質(zhì)組已有一些研究，但這些研究所鑒定出的結(jié)果間差別很大。當(dāng)前的低重現(xiàn)性是由樣品本身的差異造成的，還是由樣品處理、分離和鑒定方法不同造成的，或者這幾方面因素都有作用，尚不清楚。另一方面，在鑒定出的尿蛋白質(zhì)組中低分子量蛋白質(zhì)(<10 kDa)很少，還需要進(jìn)一步全面地進(jìn)行分析[10]。

4 尿液中幾種特殊蛋白質(zhì)的測(cè)定意義

4.1 非免疫活性白蛋白 HPLC 法與RIA比較，可以檢測(cè)所有完整的白蛋白片斷，其檢測(cè)微量白蛋白的量是RIA的2~3倍，HPLC比RIA對(duì)高危病人早期腎臟損傷的預(yù)測(cè)更敏感、更可行。臨床醫(yī)生完全可有把握的通過檢驗(yàn)報(bào)告中精確的尿微量白蛋白對(duì)疾病嚴(yán)格定級(jí)并可以有效的監(jiān)測(cè)治療效果[11]；同時(shí)還能夠發(fā)現(xiàn)更多存在危險(xiǎn)因素的患者，這對(duì)大范圍人群的篩查非常有意義[12]。尿中非免疫活性白蛋白的檢測(cè)對(duì)糖尿病腎臟疾病以及心血管疾病的早期診斷具有極大的臨床意義[13]。

4.2 白蛋白 尿中白蛋白增加提示腎小球基底膜有病理通透性改變，是球性蛋白尿的主要標(biāo)志；也是糖尿病及高血壓并發(fā)腎臟損傷的早期指征[14]。持續(xù)性微量蛋白尿較尿常規(guī)和血清腎功能檢查更敏感，也是反映腎小球功能的一個(gè)非常敏感的指標(biāo)。有很多方法可以檢測(cè)尿中白蛋白的含量，檢測(cè)范圍從極低含量的微量蛋白尿到含量極高的大量蛋白尿。新的患者經(jīng)常來測(cè)定尿中微量白蛋白作為原始資料。如果陽(yáng)性，應(yīng)該每年測(cè)定尿中白蛋白：肌氨酸酐。所有腎臟疾病、糖尿病、高血壓、代謝綜合征的患者應(yīng)該測(cè)定尿中白蛋白。

4.3 IgG 正常尿蛋白中白蛋白約占30%～40%，IgG占5%～10%，輕鏈5%，IgA3%，其余約40%為Tam-Horsfall等蛋白，在正常情況下，檢測(cè)不出大分子蛋白，如IgD和IgM等[15]。有研究報(bào)道，臨床試驗(yàn)對(duì)80例原發(fā)性腎小球腎炎進(jìn)行尿Ig檢測(cè)。尿IgG的檢出率為86.25%，其中慢性腎炎和腎病綜合征檢出率為100%，84.5%>0.10g/L；急性腎炎和隱匿性腎小球疾病檢出率為50%，有91.9%<0.10 g/L，兩者差別有非常顯著意義(P<0.01)。尿IgA檢出率為32.5%,其中腎病綜合征檢出率為62.5%，急性腎炎和隱匿性腎小球疾病均未檢出，尿IgM僅檢出1例。

4.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF） TRF對(duì)早期診斷糖尿病腎病具有良好的診斷價(jià)值，尿TRF是一種腎小球?yàn)V過功能不全的敏感指標(biāo)。目前更多證據(jù)表明，糖尿病尿液白蛋白增加之前，尿液TRF已開始升高[16]。

4.5 視黃醇結(jié)合蛋白（URBP） URBP可早期敏感地反映腎盂腎炎的腎損傷程度，且URBP敏感性高于β2-MG。同時(shí)，URBP也是診斷高血壓病早期腎損害的更敏感指標(biāo)。肺心病患者存在腎功能的損害,動(dòng)態(tài)觀察URBP水平變化是判斷其早期腎功能損害的敏感方法,能夠早期發(fā)現(xiàn)肺心病患者的腎功能損害及程度[17]。

4.6 α1酸性糖蛋白（α1AGP） α1AGP又稱血清類粘蛋白，是一種急性時(shí)相蛋白（acute phase proteins）。早期認(rèn)為只有肝臟能合成和分泌,最近發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞也能分泌α1AGP。在組織損傷和感染、炎癥反應(yīng)時(shí)血清值增高,尤以慢性炎癥為著,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、燒傷、腫瘤時(shí)增加也較明顯[18]。α1AGP水平與肝臟病變的范圍和損害程度明顯相關(guān)，動(dòng)態(tài)觀察可作為判斷病情預(yù)后的一項(xiàng)生化指標(biāo)；對(duì)肝炎、肝硬化和肝癌的鑒別診斷有一定的輔助意義。這種糖蛋白可大量結(jié)合堿性藥物如喹啉，其濃度增加可減少血清中此類游離藥物的濃度，影響藥物的作用。

采用何種方式測(cè)定尿中蛋白質(zhì)含量，應(yīng)根據(jù)具體情況分析[19]。但對(duì)于通常的病人，為評(píng)價(jià)腎臟病理性損傷及其他器官對(duì)腎臟的影響，應(yīng)在測(cè)定微量白蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇其他蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，尤其需要建立簡(jiǎn)便、快速、特異的非免疫活性尿蛋白的測(cè)定方法，及早預(yù)報(bào)腎臟病理?yè)p傷，為臨床糖尿病的早期干預(yù)贏得時(shí)間，減少因腎臟損害而進(jìn)入終末期糖尿病人的發(fā)病數(shù)。

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