新輔助化療對骨肉瘤組織中 β-catenin蛋白表達的影響

楊建柱 孫麗霞 丁洋 劉俊茹 王冬 高峰

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，惡性程度高，易發生肺轉移。隨著新輔助化療的臨床廣泛應用，術前化療已成為骨肉瘤治療不可缺少的手段。對術前化療的反應是最敏感的預后指標，且對指導術后化療有重要意義。研究發現，β-catenin和多種癌的侵襲和轉移關系密切[1，2]。然而迄今 β-catenin蛋白在骨肉瘤中表達的意義以及新輔助化療對其表達影響的相關性研究鮮見報道。本研究用免疫組化的方法檢測骨肉瘤化療前、后β-catenin蛋白表達變化，旨在探討新輔助化療對骨肉瘤β-catenin蛋白表達的影響及其與臨床病理特征的關系，并觀察化療前、后 β-catenin蛋白表達變化與腫瘤細胞壞死率(TCNR)的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院 2004年 1月至2008年1月穿刺活檢確診的 54例骨肉瘤病例，先進行新輔助化療，再進行瘤段切除加假體置換術。54例骨肉瘤患者中，男 35例，女 19例;年齡12～49歲，平均年齡 22歲。組織學類型:成骨細胞型 32例，成軟骨型 12例，成纖維型 5例，特殊類型 5例(毛細血管擴張型1例，低級別中心性 2例，骨旁骨肉瘤1例，骨膜骨肉瘤 1例)。Enneking GTM臨床分級:Ⅱb期 46例，Ⅲ期 8例。HE切片由兩位資深病理學醫生診斷核實。部位:脛骨 21例，股骨 23例，肱骨上端 5例，髂骨、恥骨 3例，腓骨 2例。另取同期骨樣骨瘤 11例，骨母細胞瘤 7例，良性病變中的反應性新生骨區域 8例。所有患者均先接受 4種藥物的新輔助化療，包括甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)8 g/m2(16 ～ 10 g)，阿 霉 素 (doxorubicin，ADM)30mg/m2連續 3 d，順鉑(cisplatin，CDP)100mg/m2，異環磷酰胺(ifosfamide，IFO)3g/m2，連續 5 d。一般為 2～ 4個療程，每療程間隔 10～14 d，然后進行手術，手術通常為瘤段切除加假體置換術。術后根據術前新輔助化療療效，再常規進行 8～12個療程的輔助化療。

1.2 試劑與方法 鼠抗人β-catenin單克隆抗體，超敏免疫組化染色試劑盒、DAB顯色劑等，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。采用免疫組化 SP法，實驗步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3 結果判斷標準 β-catenin:按照 Maruyama等[3]的方法分類，從細胞膜、細胞質、細胞核三個方面判斷 β-catenin在細胞中的特征:70%的腫瘤細胞細胞膜表達陽性為正常表達，反之為表達缺失;細胞膜表達缺失或＞10%腫瘤細胞細胞質或細胞核陽性均為異常表達;對異常表達情況再按著色強度和陽性細胞比例進行綜合評分，陽性比例 30%以下為 1分，30%～60%為2分，60%以上為 3分，著色程度:無著色為 0分(陰性)，淺黃色為 1分(弱陽性)，棕黃色為 2分(陽性)，棕褐色為 3分(強陽性)，然后根據兩者乘積的積分進行統計分析，0～3分為弱陽性(+)，≥4分為陽性(++)。TCNR是目前國際公認的從病理角度判斷化療效果較為精確的方法。具體計算參照夏賢良等[4]的方法。骨肉瘤肺轉移的診斷:術后每個月定期復查胸部 X線片，若 X線片可疑時立即 CT掃描。

1.4 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗、Fisher's精確概率法檢驗，化療后 β-catenin蛋白表達變化等級資料兩樣本比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隨訪結果 骨肉瘤 54例，隨訪時間:5～52個月，平均26.4個月。術后 2年內肺轉移率 58.97%(23/39)，2年存活率為 52.17%(24/46)。其中 8例失訪，7例是否發生肺轉移不詳，未列入統計之列。

2.2 免疫組化染色結果 β-catenin蛋白在大部分反應性新生骨、骨樣骨瘤、骨母細胞瘤中正常表達，表現為沿胞膜分布棕黃色顆粒，而在骨肉瘤中易位至胞漿和(或)胞核，為異常表達(圖 1、2)。β-catenin蛋白異常表達率在反應性新生骨、骨母細胞瘤、骨樣骨瘤及骨肉瘤中分別為 12.5%、28.57%、27.27%、66.67%。其中骨肉瘤組β-catenin蛋白異常表達率明顯高于骨樣骨瘤/骨母細胞瘤組和反應性新生骨組(P＜0.01)。但 βcatenin蛋白陽性表達率在骨樣骨瘤/骨母細胞瘤組和反應性新生骨組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表 1。

表 1 β-catenin蛋白在新輔助化療前骨肉瘤、骨樣骨瘤、骨母細胞瘤以及反應性新生骨中的表達 例

2.3 新輔助化療前β-catenin蛋白異常表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系 β-catenin蛋白異常表達率在骨肉瘤肺轉移組明顯高于無肺轉移組(P＜0.05)。除此以外，二者與患者的年齡、性別、發病部位、病理類型、臨床分期、化療后 TCNR均無關(P＞0.05)。見表 2。

表 2 新輔助化前 β-catenin蛋白異常表達與骨肉瘤臨床病理特征的關系 例

2.4 新輔助化療后骨肉瘤組織中β-catenin蛋白表達的變化新輔助化療后 54例骨肉瘤中β-catenin蛋白由低表達或高表達轉為陰性表達的分別是10例和 11例;由高表達轉為低表達的有 9例;陽性表達程度不變的有 5例;另有 1例反而由低表達轉為高表達。新輔助化療前、后β-catenin蛋白表達差異有統計學意義(P＜0.01)，見表 3。新輔助化療后骨肉瘤中 β-catenin蛋白由高表達變為低表達或表達消失(圖 3)。但骨肉瘤化療前、后 β-catenin蛋白的表達與 TCNR未存在明顯相關性(P＞0.05)。

圖 1 骨母細胞瘤中β-catenin蛋白胞膜表達(SP法×100)

圖2 化療前穿刺活檢骨肉瘤標本β-catenin蛋 白胞 漿/核 表 達(SP法 ×100)

圖 3 新輔助化療后骨肉瘤組織 β-catenin蛋白陰性表達(SP法 ×100)

表 3 新輔助化療后骨肉瘤組織中 β-catenin蛋白表達的變化例

3 討論

β-catenin是 Wnt信號途徑中的一種轉錄激活因子，在細胞中以兩種形式存在:(1)結合型，與上皮鈣黏附素(E-cadherin)結合于細胞膜的內表面，形成E-cadherin/catenin復合體，介導同種細胞間的黏附;(2)游離型，參與 Wnt信號轉導途徑，通過核膜進入到細胞核內，與 DNA親和蛋白 LEF/TCF(lym phoid enhancer factor/T cell factor)結合，激活 Wnt途徑靶基因(如 C-myc、cyclinD 1、MMP-7、CD44、Claudin-1等)，在腫瘤發生發展過程中扮演了重要的角色[5]。

本研究結果表明，從反應性新生骨、骨樣骨瘤/骨母細胞瘤、骨肉瘤，β-catenin蛋白的異常表達率逐漸增高，且骨肉瘤中β-catenin蛋白的異常表達率明顯高于反應性新生骨、骨樣骨瘤/骨母細胞瘤組。由此說明，β-catenin蛋白在骨肉瘤的發生中發揮了一定作用，檢測 β-catenin蛋白對成骨性腫瘤良、惡性判斷有參考價值。從新輔助化療前 β-catenin蛋白的表達與骨肉瘤患者臨床病理特征的關系的研究發現，β-catenin蛋白異常表達與患者是否發生肺轉移呈正相關，這與 Iwaya等[6]的研究結果一致。這說明 β-catenin蛋白與骨肉瘤的進展有關，檢測β-catenin蛋白可預測患者是否發生肺轉移，在一定程度上可判定患者預后。

本研究發現新輔助化療可降低β-catenin蛋白的異常表達，從而降低患者的肺轉移發生率，但β-catenin蛋白與TCNR未發現有相關性。化療可能通過下調骨肉瘤細胞β-catenin蛋白異常表達從而影響其生物學活性。對比檢測化療前、后β-catenin蛋白的表達，一定程度上可評價化療的療效，從而指導術后個性化化療。β-catenin的異常表達增強骨肉瘤肺轉移能力的機制目前尚不完全明了。一方面，骨肉瘤中 β-catenin胞膜表達的消失可能降低了同種細胞間的黏附，有利于腫瘤轉移。另一方面，Iwaya等[6，7]在 Dunncell(有高度轉移到肺潛能的鼠骨肉瘤細胞系)及骨肉瘤切除標本均未發現 β-catenin外顯子的突變，說明其他調節機制在激活β-catenin通路中發揮作用。Arnsdorf等[8]認為 N-cadherin介導的 β-catenin信號途徑在成骨細胞的分化中發揮著重大作用。

β-catenin在骨肉瘤的異常表達可導致肺轉移的發生，因此β-catenin及其分子可能成為未來腫瘤治療的一個靶點。對其轉移機制的深入研究可以進一步有效地指導腫瘤轉移的治療。

1 Li S，Jiao J，Lu Z，etal.An essential role for N-cadherin and beta-catenin for progression in tongue squamous cell carcinoma and their effect on invasion and metastasis of Tca8113 tongue cancer cells.Oncol Rep，2009，21:1223-1233.

2 王菲莉，郭翔，袁太澤，等.Wnt-1、β-catenin在鼻咽癌組織中的表達及其臨床意義.癌癥，2009，28:91-95.

3 Maruyama K，Ochia A，Akimoto S，etal.Cytoplasm ic beta-catenin accumulation as a predictor of hematogenousmetastasis in human colorectal cancer.Oncology，2000，59:302-309.

4 夏賢良，楊迪生，范順武，等.下肢骨肉瘤高溫隔離灌注化療初步報告.中華骨科雜志，1994，14:645-648.

5 Voutilainen KA，Anttila MA，Sillanp??SM，et al.Prognostic significance of E-cadherin-catenin complex in epithelial ovarian cancer.Clin Pathol，2006，59:460-467.

6 Iwaya K，Ogawa H，Kuroda M，et al.Cytoplasm ic and/or nuclear staining ofbeta-catenin isassociated with lungmetastasis.Clin Exp Metastasis，2003，20:525-529.

7 Haydon RC，Deyrup A，Ishikawa A.Cytoplasm ic and/or nuc lear accumulation of the beta-catenin protein is a frequent event in human osteosarcoma.Int JCancer，2002，102:338-342.

8 Arnsdorf EJ，Tummala P，Jacobs CR.Non-canonicalWnt signaling and N-cadherin related beta-catenin signaling play a role in mechanically induced osteogenic cell fate.P Los One，2009，4:5388.