Survivin基因在鼻型 NK/T細胞淋巴瘤的表達及其與腫瘤細胞增殖的關系

董英輝 金永麗 王靖華 陳龍邦 馬恒輝

鼻型 NK/T細胞淋巴瘤是一類少見的淋巴瘤亞型，具有特殊的形態學表現、免疫表型及生物學特性，對化療藥物極易產生耐藥性，生存時間短，預后不良，是近年來國內外學者的研究熱點之一。Survivin是迄今為止發現的凋亡抑制作用最強的凋亡抑制因子。Survivin的組織分布具有明顯的特征性，除胸腺和生殖腺外，Survivin在正常分化成熟的組織細胞中不表達，而當細胞發生轉化或細胞惡變時又重新獲得表達，在卵巢癌、肺癌、胃癌、惡性淋巴瘤等絕大多數腫瘤中 Survivin都有高表達。本文旨在研究凋亡抑制蛋白 Survivin在鼻型 NK/T細胞淋巴瘤中的表達，并進一步分析其表達與細胞增殖的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 50例鼻型 NK/T細胞淋巴瘤標本為 2000至2007年南京軍區南京總醫院病理科存檔蠟塊，其中男 32例，女18例;年齡 7～78歲，平均年齡 38歲;發生部位主要為鼻腔、鼻咽部、上腭等面中線部結構;所有病例診斷前均未做治療。標本均用 10%中性甲醛固定，石蠟包埋組織。參照 WHO(2000年)關于淋巴組織腫瘤分類標準，并做 LCA、CD 3ε、CD 56、Perforin、GranB免疫組化染色明確診斷和分類。另取 12例正常淋巴結組織作為對照。

1.2 實驗試劑 兔抗人 Survivin多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司(濃縮型，稀釋度 1∶200)，鼠抗人 Ki-67單克隆抗體(濃縮型，稀釋度 1∶200)、免疫組化 Envision試劑、DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發公司。

1.3 免疫組化方法 采用免疫組化 Envision System，步驟如下:組織蠟塊 4μm厚切片，脫蠟至水，高溫高壓抗原修復，一抗4℃孵育過夜，EnvisionTM試劑室溫下孵育 30min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片后光鏡下觀察。采用已知的免疫組化染色陽性標本作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定

1.4.1 Survivin染色的判斷標準:Survivin陽性物質定位于細胞質，少數定位于胞核，為淡黃色至棕黃色顆粒狀。根據陽性細胞數和著色深度計分，每例隨機觀察 5個高倍鏡(×400)視野，按下列標準計分:陽性表達細胞 ＜5%為 0分，5%～24%為1分，25% ～49%為 2分，50% ～74%為 3分，＞75%為 4分。陽性細胞表達的著色深度:基本不著色為 0分，淡黃色為 1分，黃色為 2分，棕黃色為 3分。兩者得分相乘，少于 1分的病例判定為表達陰性，其余的病例判定為表達陽性。

1.4.2 ki-67增殖指數:ki-67陽性物質定位于細胞核，為黃色至棕黃色顆粒狀。隨機選擇至少5個高倍鏡(×400)視野進行計數，每個視野計數 500個腫瘤細胞，計算ki-67陽性細胞數占總細胞數的百分比，即為ki-67增殖指數。

1.5 統計學分析 應用 SPSS 12.0統計軟件，采用 Fisher精確概率法和兩獨立樣本 t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin基因在鼻型NK/T細胞淋巴瘤和正常淋巴結組織中的表達 鼻型 NK/T細胞淋巴瘤中 Survivin陽性表達率為60%(30/50)，正常淋巴結組織中 Survivin陽性表達率為16.7%(2/12)，均呈弱陽性(圖 1)，且主要表達于少數生發中心細胞，兩者比較差異有統計學意義(χ2=7.82，P＜0.05)。

2.2 Survivin基因表達與Ki-67增殖指數的關系 Survivin陽性表達的鼻型 NK/T細胞淋巴瘤 Ki-67增殖指數為(38±16)%，而 Survivin陰性表達的鼻型 NK/T細胞淋巴瘤 Ki-67增殖指數為(23±22)%，兩者差異有統計學意義(t=2.80，P＜0.05)。Survivin陽性表達組的增殖指數顯著高于陰性組，提示 Survivin陽性表達的鼻型 NK/T細胞淋巴瘤細胞增殖活性明顯增強。見圖 2。

圖 1 Survivin在鼻型 NK/T細胞淋巴瘤中陽性表達(Envision×200)

圖 2 ki-67在鼻型 NK/T細胞淋巴瘤中的表達(Envision×100)

3 討論

Survivin在細胞增殖、凋亡和血管形成等多方面均起著重要作用。Survivin的組織分布有明顯的細胞選擇性，它表達于胚胎和發育的胎兒組織，不見于終末分化的正常成人組織(胸腺和生殖腺除外)，但在體內外分化組織、人類大多數腫瘤組織內有 Survivin的表達[1，2]，提示 Survivin在腫瘤的發生中可能具有重要作用。顧霞等[3]研究發現在不同類型的淋巴瘤中Survivin的表達水平存在明顯的差異，Survivin的高表達與高度惡性相關，并認為其可能作為淋巴瘤診斷、分型的一個分子標記。本組鼻型 NK/T細胞淋巴瘤中 Survivin陽性表達率占 60.00%，而在 12例正常淋巴結組織中 Survivin僅 2例弱陽性表達，且主要局限于少數代表 B細胞增殖的生發中心細胞，證實鼻 NK/T細胞淋巴瘤中Survivin基因表達上調，提示Survivin基因在鼻NK/T細胞淋巴瘤發生發展過程中可能起重要作用。Survivin生發中心的弱陽性表達，提示其可能對與細胞生存和增殖有一定的調節作用，或其表達受到內部微環境中的某些因素的調節。梁群英等[4，5]分別檢測了 24例和 25例鼻型 NK/T細胞淋巴瘤中 Survivin的表達，陽性率分別為 45.8%(11/24)和 68%(17/25)，均顯著高于對照組，都認為 Survivin可能參與了鼻型NK/T細胞淋巴瘤的發生發展。

作為凋亡抑制蛋白，Survivin是迄今發現凋亡抑制作用最強的凋亡抑制因子[6]。Survivin可通過多種調控機制，發揮其強大的抗凋亡作用。同時，它也是細胞周期調節因子，在抑制細胞凋亡和在細胞周期的 G2/M期中保證正常細胞分裂均起重要作用，并且具有促進細胞增殖的作用[7]。臨床研究表明，ki-67抗原的表達可反映腫瘤細胞的增殖特性，與惡性腫瘤的發展、轉移和預后高度相關[8]。在本研究中，鼻型 NK/T細胞淋巴瘤 Survivin陽性表達的 ki-67增殖指數顯著高于 Survivin陰性表達的 ki-67增殖指數，Survivin的表達與 ki-67增殖指數呈正相關，提示 Survivin可能促進鼻型NK/T細胞淋巴瘤的細胞增殖。朱紅霞等[9]發現高表達 survivin的 HEK 293細胞生長速度加快，高密度生長耐受能力也較對照高，表明 Survivin使HEK 293細胞生長中的接觸抑制作用下降，集落形成能力增強。

本研究顯示，Survivin在鼻型NK/T細胞淋巴瘤中高表達，提示Survivin在鼻型NK/T細胞淋巴瘤的發生發展中起到一定的作用。Survivin表達與腫瘤細胞增殖呈明顯正相關，表明其發揮抗凋亡作用的同時亦有促進腫瘤細胞增殖作用。這為進一步闡明 Survivin在鼻型NK/T細胞淋巴瘤發生發展中的作用具有啟發意義。

1 Sarela AI，Macadam RC，Farmery SM，et al.Expression of theanti-apoptosisgene，surviving，predicts death from recurrent colorectal carcinoma.Gut，2000，46:645-650.

2 Trieb K，Lehner R，Stulnig T，et al.Survivin expression in human osteosarcoma isa marker for survival.Eur JSurg Oncol，2003，29:379-382.

3 顧霞，林漢良.不同類型淋巴瘤 survivin的表達及其意義.癌癥，2004，23:655-661.

4 梁群英，郭瑞珍，唐文臺，等.survivin基因在鼻型 NK/T細胞淋巴瘤的表達及其與 p53和 bcl-2基因表達的關系.腫瘤防治雜志，2003，10:343-344，369.

5 明萌，鄒典定，王大斌，等.鼻NK/T細胞淋巴瘤生存素基因表達與細胞凋亡和增殖的關系.武漢大學學報(醫學版)，2004，25:501-503，520.

6 Adida C，Crotty PL，McGrath J，et al.Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosisgene survivin in human andmouse differentiation.Am JPathol，1998，152:43-49.

7 楊連粵，易彤波.caspase-3、caspase-8與 Fas介導凋亡信號轉導及其在肝細胞癌凋亡中的作用.中國現代醫學雜志，2000，10:27-29.

8 Backus HH，Van Goeningen CJ，Vos W，et al.Differential expression of cell cycle and apoptosis related proteins in colorectal mucosa，primary colon tumors，and livermetastases.JClin Pathol，2002，55:206-211.

9 朱紅霞，劉爽，周翠琦，等.抗凋亡基因 survivin促進細胞轉化的作用機制.中華醫學雜志，2002，82:338-340.