糖皮質激素受體在大鼠重癥胰腺炎中的表達變化及甲強龍沖擊治療后的影響

李樹生,熊建平,曾永明,王維剛,陳少鋒

(汕頭市潮南民生醫院普外科,廣東 汕頭 515144)

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種嚴重的分解代謝疾病,常由于劇烈的全身炎癥反應和全身性感染引起多器官功能障礙(MODS),病死率較高(10%-20%)[1]。研究表明,在創傷、失血、感染等應激情況下,糖皮質激素(Glucocorticoid,GC)分泌增多是應激的一個最重要的反應,對機體抵抗有害刺激起著極為重要的作用。GC的效應不僅取決于其在血漿中的濃度,而且還取決于靶細胞上糖皮質激素受體(Glucocorti-coidreceptor,GR)的數量和親和力[2]。動物實驗發現應激時可發生 GR的數量和親和力下降,而 GR又是體內重要的炎癥負調控因子[3],本試驗研究早期大劑量甲基強的松龍沖擊治療大鼠重癥胰腺炎,為糖皮質激素治療胰腺炎提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物 SPF級雄性 SD大鼠72只,體重(300±50)g,由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供;L-精氨酸由上海生物工程有限公司提供;戊巴比妥鈉由廣州南方化玻璃公司提供;淀粉酶檢測試劑盒,美國 Begman公司生產;兔抗大鼠 GR多克隆 IgG抗體(Santa Cruz公司生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及動物模型的制作 2009年6月至 2009年 10將 72只 SD大鼠隨機分成三組(每組 24只,每組又分 6 h、12 h、24 h三個時間點):正常對照組(NS組);重癥胰腺炎生理鹽水治療組(SAP組);重癥胰腺炎甲強龍治療組(MES組)。各組術前 12 h禁食,不禁水。動物 SAP模型是通過腹腔內注射 L-精氨酸(320 mg/100 g),L-精氨酸用生理鹽水配置成 20%濃度,第一次注射后間隔 1 h再次以相同計量腹腔內注射一次[4]。NS組將 L-精氨酸換成等量的生理鹽水,方法同 SAP、MES兩組。模型制作前 10 min通過尾靜脈注射藥物,MES組為甲基強的松龍(30 mg/kg),加入 1 ml的生理鹽水尾靜脈注射;SAP組為等量生理鹽水。三組分別在注射藥物后 6 h、12 h、24 h、72 h通過腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后剖殺大鼠取標本進行相關指標檢測。

1.2.2 實驗標本的采集 模型制作成功,注射藥物后分別于 6 h、12 h、24 h通過腹腔內注射 2%戊巴比妥鈉麻醉后心臟取血 2份,每份約 2 ml,等血液凝固,血清析出后,離心分離(3 000 r/min,10 min),放置在 -70℃冰箱凍存,用于血清淀粉酶的檢測。切取胰腺組織,一分為二,其中一半用于濕干比的檢測,另一半再分成兩份,一份用于 GR檢測,另一份用 4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后用于胰腺病理學觀察。

1.2.3 檢測指標及方法

1.2.3.1 各組大鼠 -70℃保存的血清于貝克曼 CX9全自動生化儀上檢測血清淀粉酶。

1.2.3.2 濕干比率的檢測。各組大鼠處死后,切取一半胰腺組織在電子天平上稱重,為濕重量;再將切取的胰腺組織于 60℃烘干 24 h,至質量不變,計算濕干比率。

1.2.3.3 采用單盲法,由病理科醫生在光鏡下觀察胰腺組織病理學改變。胰腺組織按照 Schmidt鏡下病理評分標準進行評分[5]:各時點隨機選取 5只大鼠的胰腺病理切片,對每只大鼠病理切片進行單獨評分,5只大鼠的平均分數為各時點大鼠胰腺的最后病理評分。

1.2.3.4 蛋白質免疫印跡法(Western Blotting)檢測胰腺組織內 GR水平。新鮮組織 100 mg,與冰預冷的 0.01 mol/LPBS充分洗滌后加入適量RIPA蛋白提取液勻漿后冰上裂解 30 min,適時振蕩,4℃離心棄去沉淀取上清。行 10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(恒壓 100 V,15 h)。待電泳完畢后轉印 2 h至 PVDF膜,按蛋白 Maker將膜分為 GR(94 kD)和內參(43 kD)兩張,室溫下 5%脫脂牛奶中封閉 2 h:(1)含有 GR蛋白條帶的膜加入兔抗大鼠 GR多克隆 IgG一抗(1∶200稀釋),4℃過夜后放入二抗為羊抗兔 IgG(1∶500稀釋)室溫反應 2 h;(2)含有內參蛋白條帶的膜放入內參抗體(1∶3 000)室溫 2 h后分別增強化學發光法顯色,X線底片曝光顯影。以顯影條帶的灰度值與內參條帶的灰度值的比值表示 GR蛋白表達水平。

1.3 統計學方法 采用 SPSS 13.0進行單因數方差分析和 LSD法兩兩比較。全部數據以均數 ±標準差(x±s)表示,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清淀粉酶 SAP組較 NS組在 6 h、12 h、24 h的血清淀粉酶值明顯升高(P＜0.01),MES組較 SAP組在 6 h、12 h、24 h的血清淀粉酶值明顯降低(P＜0.01),詳見表 1。

表1 各組血清淀粉酶活性測定結果(x±s,U/L)

2.2 胰腺組織濕干比重 SAP組較 NS組在 6 h、12 h、24 h的胰腺濕干比率明顯升高(P＜0.01),MES組較 SAP組在 6 h、12 h、24 h的胰腺濕干比率明顯降低(P＜0.05),見表 2。

表2 各組大鼠胰腺組織濕干比重結果(x±s)

2.3 胰腺組織病理學改變及評分 SAP組較NS組在 6 h、12 h、24 h的病理學評分明顯升高,MES組較 SAP組在 6 h、12 h、24 h的病理學評分明顯降低(P＜0.01),見表 3。

表3 各組大鼠不同時相胰腺組織病理學評分結果(x±s,分)

2.4 胰腺組織內 GR受體變化 SAP組較 NS組在 6 h、12 h、24 h的 GR蛋白表達明顯降低,MES組較 SAP在 6 h、12 h、24 h的 SAP組在 6 h、12 h、24 h的 GR蛋白表達明顯升高(P＜0.01),見表 4。

表4 各組大鼠胰腺組織內 GR蛋白表達變化(x±s)

3 討 論

急性胰腺炎時多種酶和生物活性物質的釋放,使得白細胞過度激活,引起炎癥介質的瀑布樣連鎖反應。正是由于多種炎癥介質的共同作用,導致急性胰腺炎從局部病變迅速發展為 SAP這一全身性病變,在胰腺組織大量壞死的同時,并發全身多個臟器功能障礙[6]。本實驗我們通過建立了 SAP大鼠模型,觀察到大鼠 SAP早期血清淀粉酶,胰腺濕干比率出現明顯升高,胰腺出現病理損傷,且隨著時間的延長,炎癥反應及胰腺病理損傷明顯加重。

甲基強的松龍屬于糖皮質激素類(GC),可以抑制多種炎癥介質的基因合成,并可通過增加抗炎蛋白的合成發揮抑制炎癥介質的作用,從而達到減輕 SIRS程度,提高 SAP大鼠的生存率。GC是通過廣泛分布的細胞內特異性糖皮質激素受體(GCR)行使其主要功能,GC-GCR復合物是體內重要的抗炎因子。多種危重病發生發展中,由于 GCR蛋白合成減少,應激反應中內源性 GC的升高及 GCR分解的加速等原因,均出現 GCR的減少[7]。GCR無備用受體,當GCR減少超過 50%時,GC-GCR復合物效應也平行地降低。盡管應激反應時內源性 GC分泌過多,但由于 GCR的顯著減少或由于炎癥反應時高細胞因子導致的 GCR抵抗[8],對機體不足以發揮正常的 GC-GCR作用。此時就必須加大 GC的用量以結合 GCR的全部,使 GCR的作用得到最大程度的利用,充分發揮 GC-GCR的抗炎作用。研究表明,在 SAP中,機體在應激時大量炎性介質產生可以影響激素受體的表達和功能,誘導轉錄活化蛋白 1和核因子 -κB(NF-κB)的過度表達,導致皮質激素受體抵抗(Corticosteroid receptor resistance,CRR),使糖皮質激素利用障礙[9]。GC是維系生命的重要活性介質和機體應激反應的基本組成部分,具有維持循環功能穩定的作用。因此,維持正常的 GR數量與功能在各種嚴重應激性疾病的治療中發揮著重要作用。在本實驗中,我們通過腹腔內注射 L-精氨酸建立大鼠 SAP模型,結果可以看出在重癥胰腺炎的早期就出現糖皮質激素受體減少,并且隨著炎癥反應的加劇,其下降程度進一步惡化。早期、大劑量的使用甲基強的松龍沖擊治療后,糖皮質激素受體水平明顯提高;同時也能有效地降低血清淀粉酶、胰腺水腫及胰腺病理損傷。但是,大劑量甲基強的松龍提高糖皮質激素受體水平的機制,本實驗尚未能闡明,我們推測,大劑量的甲基強的松龍沖擊治療后,能有效地減輕糖皮質激素受體抵抗作用,恢復其正常時的濃度,但確切的機制有待于今后進一步的實驗研究闡明。

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