不同條件影響冷凍血小板質量的研究

陳興智,李聚林,韋常健

(廣西壯族自治區血液中心,廣西 柳州 545005)

血小板輸注是臨床治療因血小板減少或血小板功能障礙所致的出血等疾病的重要手段,目前可供應臨床輸注的血小板制劑有多種類型,主要有濃縮血小板和單采血小板制劑。以保存方式可以分為4℃冷藏、22℃常溫保存、血小板冰凍干燥保存和深低溫冰凍保存等。4℃冷藏血小板對細胞功能活性損傷很大,基本已經不被使用,22℃常溫保存比較普遍,但是保存時間比較短,一般只有 5-7 d,低溫冰凍干燥保存技術使用受眾多因素影響,一時難以推廣,而深低溫保存冰凍血小板技術設備要求不高,也容易推廣使用,目前許多血液中心或中心血站都開展這個項目,然而冷凍血小板制備與保存過程的質量問題是直接影響臨床使用效果的主要原因。筆者對影響深低溫保存冰凍血小板制備質量的多種因素進行研究,現報道如下:

1 材料與方法

1.1 設備 -80℃超低溫冰箱,型號:MDF-382E,日本 SANYO生產;-135℃超低溫冰柜,型號:MDF-2136,日本 SANYO生產;42℃電熱恒溫水浴箱,型號:BHW-2,北京醫療設備廠生產;數字顯示測溫儀,規格型號:FLuKE 50S＆50DKJ,美國進口;血小板保存箱,型號:PC 100 h和型號:PC 1200i,美國進口;澄明度檢測儀,型號:CM-Ⅲ,天津大學無線電廠生產。

1.2 方法

1.2.1 5%-6%二甲基亞砜(DMSO)加入到機采血小板中,血小板采集量均≥2.8×1011/袋;分別放置于調節并顯示溫度為 -80℃至 -120℃之間的超低溫保存箱中冷凍保存。臨床輸注前迅速把不同保存溫度的冷凍血小板取出立即于 42℃水浴箱中融化解凍復蘇,時間控制在 3 min左右。然后在澄明度檢測儀前觀察判斷冷凍血小板的穩定性。如果在澄明度檢測儀前肉眼觀察有絮狀不可逆聚集物或纖維蛋白等則判斷質量為不合格;如果無以上現象出現,血小板呈均勻云霧狀則判質量為合格。

1.2.2 方式 1:血小板由 -80℃超低溫冰箱凍結后由于出現質量問題轉移入 -135℃超低溫冰柜保存;方式 2:直接將血小板放入 -135℃超低溫冰柜凍結進行冰凍保存;方式 3:將血小板由 -85℃凍結成型后降溫至 -135℃再升溫至 -85℃條件下解凍。冷凍血小板復蘇后分別室溫下放置玻璃或瓷磚冷面介質、導熱慢的紗布或毛巾等不同介質上保存一定時間,觀察血小板質量情況。

1.2.3 統計學分析 使用 SPSS統計學軟件對數據進行卡方檢驗。

2 結 果

2.1 實驗中發現不是所有溫度到達 -135℃保存的血小板都會發生爛袋等質量問題。經過對方式1、方式 2、方式 3三種不同冷凍、解凍方式進行考察分析,發現保存成型的溫度和解凍溫差是絮狀不可逆聚集或纖維蛋白析出及爛袋等的主要原因。見表1。

表1 凍結與解凍溫差對血小板解凍后質量的影響情況[例(%)]

2.2 -90℃條件保存的冷凍血小板共 1 483袋,其中 4袋融化解凍后放置于玻璃、瓷磚、不銹鋼平面上,5 min左右出現絮狀或纖維蛋白析出等。而解凍融化后放置于木板介質上或放置保存箱內震蕩的 1 479袋均無絮狀或纖維蛋白析出,與放置瓷磚或玻璃比較差異有統計學意義,見表 2。

表2 冷凍血小板融化后放置不同介質上纖維蛋白及絮狀不可逆聚集物析出情況統計分析

2.3 2003年至 2008年我中心制備冷凍血小板在加藥前均未經過震蕩,冷凍保存于 -85℃至 -120℃超低溫冰箱中的1 101袋冷凍血小板均已經融化復蘇并應用于臨床,未發現復蘇后絮狀不可逆聚集物和纖維蛋白析出。見表 3。

表3 加藥前未震蕩保存于 -85至 -120℃條件下的冷凍血小板融化復蘇后放置于(22±2)℃保存質量分析

3 討 論

血小板在參與機體凝血過程中發揮了重要的止血功能,尤其是肝臟移植手術中嚴重出血患者及時補充血小板及凝血因子可消除其凝血障礙[1]。隨著臨床醫生的輸血理念的改變,臨床輸血技術的不斷提高,血小板輸注在臨床血液輸注中占有很大的比率。然而,血小板保存在 4℃條件下活性很快下降。22℃持續振蕩保存對血小板活力維持的可靠性和穩定性已經被公眾認可。但是 22℃保存的血小板保存時間短,不能長期保存,采供血機構在“無償獻血”血液資源寶貴的情況下,也不能大量采集以免造成浪費,勢必影響臨床緊急情況的需求。在深低溫條件,血小板細胞膜內外的水分都處于凝固狀態,細胞生命代謝基本停止,血小板及凝血因子等功能活性物質可長期保存而不會衰退或功能耗竭,在降復溫過程中添加冰凍保護劑保護下可以降低血小板低溫保存經歷降復溫過程的損害,從而達到低溫保存的目的[2]。冷凍血小板制備過程中或多或少出現絮狀物的情況,并且隨著保存時間的延長而出現概率逐漸增加[3]。

眾多資料表明,DMSO作為冷凍保護劑,不控制降溫速度情況,-80℃冰箱冷凍保存血小板在臨床應用中具有顯著的效果。同樣也有報道 -80℃冷凍保存血小板融化復蘇后有絮狀不可逆聚集物或纖維蛋白析出等不穩定現象的發生[4]。筆者研究發現,方式 1:血小板由 -80℃超低溫冰箱凍結后由于出現質量問題轉移入 -135℃超低溫冰柜保存血小板 150人份,結果出現不穩定因素的有 36人份;方式 2:直接將血小板放入 -135℃超低溫冰柜凍結進行冰凍保存 7份均爛袋。方式 3:將血小板由 -85℃凍結成型后降溫至 -135℃再升溫至 -85℃條件下解凍 132人份均無爛袋或絮狀聚集物或纖維蛋白析出,與前兩者比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。調節冰箱溫度為 -80℃時,在 0℃以下冷凍保存血小板內部實際降溫速度較慢,特別是關鍵的 0℃和 -30至 -40℃之間的下降速度;而冰箱調節溫度在 -85℃以下,冷凍保存血小板內部實際降溫速度可以達到1℃-3℃/min[5]。正是這種原因導致方式 1影響血小板的保存質量,同時表明,一旦保存過程導致質量的問題是無法復原的。

在處理醫院退回有絮狀聚集物血小板的調查中發現,醫院取回冷凍血小板進行出入庫登記過程,將血小板暫存于玻璃或瓷磚等導熱性能較好的介質上,導致了冷凍血小板出現絮狀聚集物析出。而我們進行出入庫過程將血小板放置室溫紗布、毛巾介質或(22±2)℃暫存,均未發生類似質量問題。筆者總結發現冷凍血小板融化后輸血前放置的介質對血小板質量有影響,即導熱性能好的玻璃或瓷磚上放置融化后的血小板 100%出現絮狀聚集物,而室溫條件下短時間放置墊有紗布、毛巾介質或(22±2)℃保存,絮狀聚集物為 0%,兩者比較差異有統計學意義(x2=547.69,P＜0.01)。

長時間實踐表明,冷凍血小板具有止血效果好、作用快等特點,經臨床應用觀察證明其安全可靠[6],其冷凍保護劑 DMSO在其他血液成分保存中也有應用[7]。血小板放置 -85℃至 -120℃之間保存,臨床使用前融化復蘇,放置于室溫內的紗布、毛巾介質上或(22±2)℃保存箱暫短存放可保持良好的穩定性。影響冷凍保存血小板質量的因素眾多,綜合考慮各方面因素可以避免冷凍血小板融化復蘇過程或復蘇后絮狀聚集物或纖維蛋白析出,從而確保冷凍血小板的質量,保證臨床輸注血小板的有效性,相信在應急儲備及臨床急救方面一定能發揮重要的作用。

[1] 曾永芳,郭 鵬,陳方祥,等.血小板、冷沉淀在肝臟移植術中的聯合應用[J].重慶醫學,2009,38(12)∶1 431-1 432.

[2] 劉景漢,車 輯.血小板保存[J].中國輸血雜志,2008,21(4)∶241-242.

[3] 薄玉芳,丁國良.冰凍前存放時間對冰凍血小板質量的影響[J].臨床輸血與檢驗,2008,10(1)∶75.

[4] 孫艷萍,袁 媛,陳召江,等.冰凍血小板融化復蘇后不可逆聚集的原因分析[J].臨床輸血與檢驗,2005,7(2)∶88-89.

[5] 陳興智,李聚林,張 源,等.冷凍血小板穩定性的研究[J].臨床輸血與檢驗,2008,10(1)∶48-51.

[6] 李聚林,羅 志,何偉蘭,等.冷凍血小板臨床應用的比較研究[J].廣西醫學,2005,27(10)∶1 534-1 536.

[7] 莊 遠,劉景漢,歐陽錫林,等.二甲基亞砜在人紅細胞凍干前負載海藻糖過程中的作用[J].中國輸血雜志,2007,20(2)∶93-95.