酶解乳清濃縮蛋白WPC80制備乳清肽的研究

任國譜，余 兵

(中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

酶解乳清濃縮蛋白WPC80制備乳清肽的研究

任國譜，余 兵

(中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

用乳清濃縮蛋白WPC80為原料，在復合酶A的作用下，研究乳清肽的制備工藝。復合酶A的反應條件為[S]12g/100mL、溫度50℃、[E]/[S]3%、pH9.0。選用截留分子質量10kD的磺化聚砜膜，常溫并在工作壓差0.25MPa下對水解液進行超濾處理后，選用樹脂HZ00x對水解液進行脫苦，得到的處理液無明顯的苦澀味，只有輕微的蛋腥味，最后肽得率36.54%。產品中肽的分子質量分布以二、三和四肽為主，分別占峰面積的27. 45%、34.88%和26.65%。

乳清肽；蛋白酶；乳清濃縮蛋白

乳清粉是干酪生產中的副產物，乳清濃縮蛋白WPC80是蛋白質含量為80%以上的乳清濃縮蛋白，具有較高的生物價和良好的功能特性。但乳清蛋白中的β-乳球蛋白和免疫球蛋白E(IgE)常常引起一些人群的過敏反應[1-5]，因此，部分水解乳清蛋白或深度水解乳清蛋白是防止過敏反應的有效方法之一。另外，酶解乳清蛋白產生的乳清肽具有多種生物活性功能，包括抗菌[6-7]、抗高血壓[8-9]、鎮靜和增進新陳代謝的同化作用等[10-11]。

目前，通過酶解技術生產肽類物質的研究較多[9,12]，但對于應用于防止過敏的嬰幼兒食品的乳清肽配料的研究較少。對后者的生產，除了要考慮肽的大小和肽的得率外，還需考慮風味控制和灰分含量等指標。本實驗選用WPC80作為制備乳清肽的原料，研究其生產工藝過程及其工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

WPC80 戴維林國際工貿有限公司；粉末活性炭(80～120目) 北京大力精細化工廠；大孔吸附樹脂(HZ801、HZ802、HZ803、HZ00x) 上海華震科技貿易公司。

堿性蛋白酶(活力20萬U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司；木瓜蛋白酶(活力300U/g) BIB分裝；復合酶A(由堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶復合而成，質量比為1:2) 自制；乙腈(色譜純) 江蘇淮陰精細化工研究所；其余試劑均為市售分析純試劑。

8200型超濾杯 美國Millipore公司；超濾膜(磺化聚砜膜，型號分別為SPES20、SPES50、SPES100，對應的截留分子質量分別為2、5、10kD) 美國星達膜業有限公司；DYY-1C型電泳儀 北京市六一儀器廠；2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司；Merck反相C18柱(用于肽譜的分析)、分離柱Shodex protein KW-803(用于肽的分子質量分布分析) 上海曦玉分析儀器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質的分子量分布

采用SDS-PAGE法[13]測定。

1.2.2 肽高效液相色譜的分析條件

采用HPLC法[9]。檢測波長220nm；進樣量10μL；流速1.0mL/min。線性梯度洗脫：A液，V(乙腈):V(水): V(三氟乙酸)=5:95:0.1；B液，V(乙腈):V(水):V(三氟乙酸) =95:5:0.1。在50min內，B液從5%到70%。

1.2.3 肽的分子質量分布

采用HPLC法[9]。檢測波長220nm；進樣量10μL；流速0.5mL/min；流動相：V(乙腈):V(水):V(三氟乙酸) =10:90:0.1；回歸方程：lgMW=3.8917－0.063t，R2=0.9935。

1.2.4 肽質量濃度的測定

采用雙縮脲法[14]測定肽質量濃度。

1.2.5 灰分的測定[15]

將酶解后的WPC80干燥后，取干燥樣進行灰分的測定，用g/100g(干基)表示。

1.2 6肽得率

1.2.7 酶解液風味的判定

異味等級分為5級，分別表示為無(0)、輕微(1)、較重(2)、重(3)和嚴重(4)。品嘗小組成員7人，打分后求其平均值，然后與相應的異味等級相對應。

1.2.8 工藝流程

生產乳清肽的工藝流程：WPC80→加水還原(水溫40～60℃)→酶解→滅酶→超濾→吸附脫苦→殺菌濃縮→噴霧干燥→成品

2 結果與分析

2.1 水解用酶的選擇及酶解條件的確定

一個酶解反應的進行，主要涉及到底物的質量濃度、水解酶質量分數(以[E]/[S]的百分數表示)、pH值、水解溫度T/℃和水解時間t/min等因素的影響。通過酶的篩選研究[12]，確定底物的質量濃度12g/100mL、溫度50℃、時間60min，這樣需要通過實驗確定pH值和酶的質量分數[E]/[S]。

pH值的選擇除了考慮酶的穩定性和底物的特殊性外，還要考慮酶解液的風味和灰分含量。復合酶A在pH7～12都有活性，WPC80在此pH值范圍內都有較好的溶解度，用灰分含量為考核指標，在[S]12g/100mL、水解溫度50℃、水解時間60min、[E]/[S]為3%的條件下，選取不同的pH值進行酶解反應，結果見圖1。

圖1 pH值對灰分的影響Fig.1 Effect of pH on ash content of hydrolyzed WPC 80

過高pH值不僅會影響產品的質量和風味，而且從圖1可以看出，pH值增加，酶解物中的灰分也明顯增加，因此，選p H值為9.0。

在pH9.0、[S]12g/100mL、水解溫度50℃、水解時間60min條件下，選取不同的[E]/[S]進行酶解反應，結果見圖2。

圖2 [E]/[S]對肽得率的影響Fig.2 Effect of enzyme/substrate ratio on peptide yield

從圖2可以看出，[E]/[S]超過3%時肽得率增長緩慢，而且超過7%時趨勢線不再規則，可能有副反應發生，因此，選擇[E]/[S]為3%。

2.2 風味曲線及水解程度的控制

圖3 復合酶A水解WPC80的風味曲線Fig.3 Bitterness change during WPC 80 hydrolysis

圖3是復合酶A在所選用的條件下水解WPC80得到的風味曲線。

圖4 制備乳清肽的時間-肽得率圖Fig.4 Time course of peptide yield during WPC 80 hydrolysis

在控制風味的前提下，應盡量提高水解度。結合肽得率和風味曲線綜合考慮，生產乳清肽時，應選擇風味較好的高水解度點，以確保肽的得率。從圖4來看，酶解反應1h后肽得率增加緩慢，而且隨著時間的增加苦味程度增加，直到3h后水解液苦味才減輕。因此，在所選用條件下水解1h，離心后得到的肽得率為47.24%，水解液苦味程度中等，是較為合適的。

2.3 酶解過程中蛋白質分子質量的變化(SDS-PAGE)

WPC80經酶解離心(4000r/min，10min)除去不溶物后，可溶解部分既有大分子質量的蛋白，也有較小相對分子質量的肽類和游離氨基酸，圖5是復合酶A水解WPC80的過程中，用SDS-PAGE法測定分子質量，所得到的WPC80的分子質量變化圖。隨著反應時間的延長，水解反應趨于平緩，經150min后已經水解完全。

圖5 酶解WPC80水解時間-分子質量動態變化Fig.5 SDS-PAGE analysis of WPC 80 hydrolysis process

2.4 酶解液的分離

為了得到乳清肽，需要除去分子質量大的成分，選用超濾技術來分離乳清肽。水解滅酶(90℃、10min)并離心(4000r/min、15min)后，在常溫0.25MPa操作壓力條件下，超濾結果見表1。

表1 不同截止分子質量(COMW)的超濾膜的超濾結果Table1 Peptide yields after ultrafiltration through different MWCO membranes

使用COMW 2kD的膜，肽的得率降低，COMW 5kD的膜比較適中，但考慮到肽的得率，選用COMW 10kD的膜。

2.5 吸附脫苦

超濾后的WPC80水解液呈淺黃色，酶解液具有明顯的苦味和其他不良風味，為了改善外觀和口味，則需要進行吸附脫苦處理。

表2 脫苦處理對產品回收率和風味的影響Table2 Effect of resin type used for debittering on peptide recovery and flavor

表2比較了幾種吸附劑的脫苦效果及其對產品回收率的影響，吸附劑的脫苦操作條件是40℃，磁力攪拌1 h。

通過比較，用樹脂HZ00x進行處理結果理想，其回收率為90.20%，肽得率為36.54%，處理液無明顯苦澀味，只有輕微的蛋腥味。

2.6 肽的HPLC譜圖

圖6是酶解液超濾和吸附脫苦后，用HPLC法得到乳清肽的譜圖。可見，經過一系列的分離后，得到的乳清肽的組成成分仍然很復雜。

圖6 乳清肽的HPLC分析圖譜Fig.6 HPLC profile of the product obtained after ultrafiltration and debittering

2.7 肽的分子質量分布

圖7是HPLC法測得的最終產品的分子質量分布圖。據回歸方程計算，產品中的主要成分中，二、三和四肽的數量最多，相對百分比分別占峰面積的27.45%、34.88%和26.65%，其他為11.02%，是比較理想的分布模式。

圖7 HPLC法測定肽的分子質量分布Fig.7 HPLC analysis of molecular weight distribution of the final product obtained

3 結 論

3.1 復合酶A水解WPC80，其反應條件為[S]12g/ 100mL、水解溫度50℃、[E]/[S]3%、pH9.0，在此條件下水解1h，其水解液苦味程度中等，肽得率為47.24%。3.2選用截留分子質量為10kD的磺化聚砜膜，常溫下在工作壓差為0.25MPa下對水解液進行超濾處理，肽得率40.51%。

3.3 選用樹脂HZ00x對水解液進行脫苦處理，處理液無明顯的苦澀味，只有輕微的蛋腥味，肽得率36.54%。

3.4 HPLC法測得的最終產品的分子質量分布以二、三和四肽的數量最多，分別占峰面積的27.45%、34.88%和26.65%，其他為11.02%，是比較理想的分布模式。

[1]MORALES P, FERNANDEZ-GARCIA E, GAYA P, et al. Hydrolysis of caseins and formation of hydrophilic and hydrophobic peptides by wild Lactococcus lactis strains isolated from raw ewes milk cheese[J]. Journal of Applied Microbiology, 2001, 91: 907-915.

[2]TOMITA M, BELLAMY W, TAKASE M, et al. Potent antibacterial peptides generated by pepsin digestion of bovine lactoferrin[J]. J Dairy Sci, 1991, 74: 4137-4142.

[3]BENNETT L, WHEATCROFT R, SMITHERS G. A review of allergic and intolerant reactions to dairy protein experienced by non-infant consumers[J]. Australian Journal of Dairy Technology, 2001, 41(2): 126-129.

[4]ISABELLE N, SYLVIE G, SYLVIE L T. Interaction between bovine β-lactoglobulin and peptides under different physicochemical conditions [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50: 1587-1592.

[5]LEE Y S, NOGUCH T, NATIO H. Intestinal absorption of calcium in rats given diets containing casein or amino acid mixture: the role of casein phosphopeptides[J]. Br J Nutr, 1983, 49: 67-76.

[6]MEI H, FRISTER H. Chemical characterization of bioactive peptides from in vivo digests of casein[J]. J Dairy Res, 1989, 56: 343-349.

[7]TRUCHITA H, GOTO T, SHIMIZU T, et al. Dietary casein phosphopetides prevent bone loss in aged ovariectomized rats[J]. J Nutr Sci, 1996, 126(1): 86-93.

[8]MANNHEIM A, CHERYAN M. Continuous hydrolysis of milk protein in a membrane reactor[J]. J Food Sci, 1990, 55(2): 381-390.

[9]吳建平, 丁霄霖. 大豆降壓肽的研制[D]. 無錫: 無錫輕工大學, 1998: 25-26.

[10]FOEGEDING E A, DAVIS J P, DOUCET D, et al. Advances in modifying and understanding whey protein functionality[J]. Trends in Food Science and Technology, 2002, 13(5): 151-159.

[11]LAJOIE N, GAUTHIER S F, POULIOT Y. Improved storage stability of model infant formula by whey peptides fractions[J]. J Agric Food Chem, 2001, 49(4): 1999-2007.

[12]任國譜, 李忠海, 彭燦, 等. 高蛋白低聚肽奶粉生產用酶的篩選研究[J]. 食品科學, 2009, 30(3): 197-200.

[13]陳曾夑, 劉兢, 羅丹. 生物化學實驗[M]. 合肥: 中國科學技術大學出版社, 1994: 26-31.

[14]任國譜, 李忠海, 彭美純, 等. 奶粉中低聚肽質量濃度測定方法[J].中國乳品工業, 2007, 35(10): 47-50.

[15]GB/T 5413.7—1997嬰幼兒配方食品和乳粉中灰分的測定[S].

Enzymatic Preparation of Oligo-peptides from Whey Protein Concentrate 80

REN Guo-pu，YU Bing (College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

Whey protein concentrate (WPC) 80 was hydrolyzed with an enzyme complex consisting of alacase and papain (1: 2 mass ratio) to prepare oligo-peptides in the present study. The hydrolysis conditions for the preparation of oligo-peptides were as follows: substrate concentration, 12 g/100 mL; reaction temperature, 50 ℃; and pH 9.0. The hydrolysate was ultrafiltrated through a sulfonated polysulfone membrane having a molecular weight cut-off (MWCO) of 10 kD under the conditions of normal temperature and 0.25 MPa working pressure difference and debittered by HZ00x resin adsorption. The resultant product had a little bitter taste and a light egg odor. The peptide yield was 36.54% under the above process conditions. The molecular weight distribution of peptides in the final product was mainly dipeptides, tripeptides and tetrapeptides, representing 27.45%, 34.88% and 26.65% of the total peak area, respectively.

whey peptide；enzyme；whey protein concentrate

TS252.9

A

1002-6630(2010)20-0011-04

2010-01-05

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD04A15)

任國譜(1964—)，男，教授，博士，研究方向為功能性乳制品。E-mail：topren@vip.163.com