響應面分析法優化香菇中γ-谷氨酰轉肽酶的超聲輔助提取條件

勵建榮，尹 潔，朱軍莉，章 慶

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310035)

響應面分析法優化香菇中γ-谷氨酰轉肽酶的超聲輔助提取條件

勵建榮，尹 潔，朱軍莉，章 慶

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310035)

采用響應面分析法對香菇中γ-谷氨酰轉肽酶的超聲提取工藝進行優化。在單因素試驗基礎上，根據中心組合(Box-Benhnken)試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析法，以γ-谷氨酰轉肽酶的提取率為響應值進行回歸分析。結果表明超聲輔助提取GGT的最佳條件為提取功率、提取時間、料液比的最佳條件分別為204.84W、28.19min、1:52.29。在上述提取條件下，提取液中GGT的提取率達到11.19U/g，與模型預測值基本相符。

香菇；γ-谷氨酰轉肽酶；超聲輔助提取；響應面法

很多生物體都會產生內源性甲醛，其中以香菇最為突出，2001年“香菇甲醛”事件使我國食用菌產業蒙受巨大損失。香菇中內源性甲醛的研究始于上世紀70年代，日本學者Yasumto[1-4]及Fujimoto等[5]首次對香菇甲醛的形成機理作了研究報道，他們將粗酶提取液作用于滅酶的香菇勻漿液，發現香菇甲醛是其特征風味物質酶學代謝途徑的副產物，其中γ-谷氨酰轉肽酶(γglutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)是該催化反應產生甲醛的關鍵酶[6]。目前對細菌、酵母中GGT的研究較多，對香菇中GGT的研究較少，對其提取效率的研究更少。對該酶的結構及其酶學性質研究有助于進一步明晰甲醛在香菇風味物質形成途徑產生的機理，并且為開發香菇甲醛產生的抑制方法提供科學的參考依據。而香菇中蛋白質含量較低，要獲得足夠量且活力未嚴重損失的GGT粗酶液以供進一步研究，提取效率的提高十分關鍵。已知GGT是廣泛存在于生物體內參與谷胱甘肽循環的酶，該酶主要存在于細胞膜的外表面上，通過亞基和細胞膜相連[7]，使常規靜置提取法提取率較低。超聲波技術用于蛋白質及酶的提取具有明顯的優勢，與靜置提取法相比，超聲波產生的強烈振動、空化效應、攪拌作用等可以加速提取成分的釋放，提高提取率，有效縮短提取時間[8-10]。本實驗采用超聲輔助提取法改進香菇中GGT的提取工藝，為深入研究GGT及香菇內源性甲醛的形成機理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇采自浙江慶元，經真空冷凍干燥后粉碎，保存于－70℃；γ-谷氨酰-對硝基苯胺(γ-glutamyl-P-nitroanilide)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)、對硝基苯胺(P-nitroanilide) 美國Sigma公司；其余試劑為國產AR級試劑。

1.2 儀器與設備

UV2550紫外可見分光光度計 日本島津公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 上海新芝生物技術研究所；DELTA320 pH計 美國Mettler Toledo公司。

1.3 香菇GGT的提取方法

準確稱取1.00g香菇粉置于100mL三角燒瓶中，加入一定量0.5mol/L Tris-HCl(pH 7.6)緩沖液，放置在冰浴環境中，用超聲輔助提取法提取GGT，將該提取液8000 ×g離心20min后取上清液測酶活，計算得率。

1.4 酶活測定方法及提取率計算

GGT催化γ-glutamyl-P-nitroanilide的產物P-nitroanilide在410nm處有吸光度[11]，酶活性由生成產物的量反映。反應體系為0.5mol/L Tris-HCl(pH7.6)緩沖液4.0mL、酶液 0.5mL、3.5μmol/mL底物0.5mL，37℃反應20min，加入3mL 1.5mol/L乙酸終止反應，過濾后在410nm處測吸光度(A)。酶活單位(U)定義為在上述反應條件下，每分鐘生成1μmol的P-nitroanilide為1個酶活單位。

GGT提取率/(U/g)=樣品GGT活性/香菇粉質量

1.5 單因素試驗和響應面試驗

超聲輔助提取法單因素試驗分析不同料液比、提取時間、功率對GGT得率的影響。具體為稱取1.00g香菇粉，分別加入0.5mol/L Tris-HCl(pH7.6)緩沖液25、50、75、100、150mL，在4℃提取功率200W條件下提取10min；相同處理條件下，在4℃提取功率200W條件下分別提取5、10、20、30、40min；相同處理條件下，提取功率分別在50、100、150、200、250W條件下提取10min。根據單因素試驗，結合Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，采用響應面分析法優化GGT的超聲輔助提取法料液比、提取時間和功率提取工藝。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助提取GGT的單因素試驗

2.1.1 料液比對GGT提取率的影響

設計料液比分別為1:25、1:50、1:75、1:100和1:150，在提取功率200W條件下超聲提取10min，以考察料液比對GGT含量的影響(圖1)。由圖1可知，隨著料液比的提高，GGT提取率不斷增加，當料液比達到1:50后，進一步增加溶液的量，溶液中GGT含量增加不明顯。高料液比條件下，GGT總的溶出量增加，提取過程中液相濃度增加快，兩相濃度差減少加快[12]。高料液比在一定程度上提高傳質推動力，但從提取效果、原料用量等方面綜合考慮，確定料液比1:50較適宜。

圖1 料液比對GGT提取率的影響Fig.1 Effect of material/water ratio on GGT extraction

2.1.2 提取功率對GGT提取率的影響

圖2 提取功率對GGT提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on GGT extraction

固定料液比1:50，提取功率分別為50、100、150、200、250W超聲提取10min，考察提取功率對GGT提取率的影響(圖2)。由圖2可知，提取功率對GGT提取率具有顯著的影響。功率越高，GGT提取率越高，兩者呈線性正相關關系。提取功率越高，對香菇細胞的破壞作用越大，溶劑擴散也越快，越有利于GGT的浸出。當功率大于200W時，進一步增加提取功率，GGT提取率下降。這可能是因為過高的功率產生的瞬間高溫會使GGT的活性降低，因此，選擇200W為較佳的提取功率。

2.1.3 提取時間對GGT提取率的影響

固定料液比為1:50，在提取功率為200W條件下分別超聲提取5、10、20、30、40min，以考察提取時間對GGT提取率的影響(圖3)。由圖3可知，提取時間對GGT提取率有著顯著的影響，在30min時GGT提取率最大，而后隨著提取時間的進一步延長，GGT提取率出現了明顯的下降趨勢。超聲促進胞內的GGT釋放并擴散到胞外的溶劑中，大部分存在于破碎細胞內的GGT在最初的30min內釋放到提取溶劑中，因而GGT提取率在這段時間內發生了顯著的增長。但是過長時間的超聲作用可能導致部分GGT結構破壞，GGT活性也隨之下降，據此初步確定30min為較適宜的提取時間[13]。

圖3 提取時間對GGT提取率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on GGT extraction

2.2 采用響應面法優化GGT的提取工藝

2.2.1 響應面分析的試驗設計及結果

根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理[14-16]，利用Minitab15軟件進行Box-Behnken試驗設計，試驗因素和水平設計見表1，試驗方案及結果見表2。

表1 響應面分析法的因素與水平表Table1 Factors and levels in the response surface design

表2 響應面分析結果Table2 Response surface design matrix and experimental results

表3 回歸方程的方差分析Table3 Variance analysis of the developed regression model

用Design-expert 7.0 對試驗結果進行回歸分析及方差分析，擬合得到回歸方程為Y=10.43＋0.47A＋2.13B－0.025C+0.31AB－0.53AC－1.23BC－1.88A2－6.11B2－0.80C2

從表3可以看出，回歸方程因變量和自變量之間的線性關系顯著(R2=0.9187)，方程P= 0.0285＜0.05，說明此回歸方程顯著；失擬項P=0.0970＞0.05，說明方程對實驗的擬合度較好，此實驗方法可靠。

2.2.2 提取工藝的確定及驗證實驗

顯著因素水平的優化運用Design-expert 7.0 軟件對回歸模型進行規范性分析，尋求最大提取率的穩定點及對應的因素水平，結合圖4～6給出的回歸方程的三維響應面圖和等高線圖可知，回歸模型存在穩定點，穩定點即最大值。對回歸方程求極值點得：A=0.0968，B=－0.1811，C=0.0914，Y=9.897，即提取功率、提取時間、料液比的最佳值分別為204.84W、28.19min、1:52.29，此時GGT提取率達到最大值為11.19U/g。在此條件下進行3次驗證實驗，GGT平均提取率為11.07U/g，與理論值基本相符，這說明回歸方程能較真實地反映各因素對GGT提取率的影響。

圖4 提取功率與提取時間對GGT提取率交互影響效應響應面圖及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of ultrasonic power and extraction duration on GGT extraction

圖5 提取功率與料液比對GGT提取率交互影響效應響應面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of ultrasonic power and material/water ratio on GGT extraction

圖6 提取時間與料液比對GGT提取率交互影響效應響應面立體分析圖及其等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of extraction duration and material/water ratio on GGT extraction

3 結 論

本實驗選取料液比、提取時間、提取功率3個因素進行響應面試驗設計。采用Box-Behnken設計和Minitab15、Designexpert 7.0軟件進行設計和分析，得到超聲輔助提取GGT的最佳條件為：提取功率、提取時間、料液比的最佳條件分別為204.84W、28.19min、1:52.29。在最佳提取條件下，提取液中GGT的提取率達到11.19U/g，與理論值基本相符。這說明回歸方程較真實地反映各因素對GGT提取率的影響。

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Optimization of Conditions for Ultrasonic-assisted Extraction of γ-Glutamyltranspeptidase from Shiitake Mushroom by Response Surface Methodology

LI Jian-rong，YIN Jie，ZHU Jun-li，ZHANG Qing
(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

In order to optimize the ultrasonic-assisted extraction of γ-glutamyltranspeptidase (GGT) from shiitake mushroom, single factor investigations were initially carried out, followed by construction of a three-factor, three-level Box-Benhnken experimental design, quadratic regression fitting for GGT activity as a function of three extraction conditions and response surface analysis. The optimal conditions for the ultrasonic-assisted extraction of GGT were found to be: ultrasonic power, 204.84 W; extraction duration, 28.19 min; and material/water ratio, 1:52.29. Under the above conditions, the experimental value of GGT activity was 11.19 U/g, which was in basic agreement with the model predicted value.

shiitake mushroom；γ-glutamyltranspeptidase；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

Q949.329.81；O658

A

1002-6630(2010)20-0020-04

2009-10-18

教育部科學技術研究重點項目(208054)；浙江省自然科學基金項目(R3090330)；國家質檢總局科技計劃項目(2009IK180)

勵建榮(1964—)，男，教授，博士，研究方向為農產品、水產品貯藏加工與安全控制及食品生物技術。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn