響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的超聲輔助提取條件

勵(lì)建榮，尹 潔，朱軍莉，章 慶

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的超聲輔助提取條件

勵(lì)建榮，尹 潔，朱軍莉，章 慶

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035)

采用響應(yīng)面分析法對(duì)香菇中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明超聲輔助提取GGT的最佳條件為提取功率、提取時(shí)間、料液比的最佳條件分別為204.84W、28.19min、1:52.29。在上述提取條件下，提取液中GGT的提取率達(dá)到11.19U/g，與模型預(yù)測(cè)值基本相符。

香菇；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；超聲輔助提取；響應(yīng)面法

很多生物體都會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性甲醛，其中以香菇最為突出，2001年“香菇甲醛”事件使我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)蒙受巨大損失。香菇中內(nèi)源性甲醛的研究始于上世紀(jì)70年代，日本學(xué)者Yasumto[1-4]及Fujimoto等[5]首次對(duì)香菇甲醛的形成機(jī)理作了研究報(bào)道，他們將粗酶提取液作用于滅酶的香菇勻漿液，發(fā)現(xiàn)香菇甲醛是其特征風(fēng)味物質(zhì)酶學(xué)代謝途徑的副產(chǎn)物，其中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γglutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)是該催化反應(yīng)產(chǎn)生甲醛的關(guān)鍵酶[6]。目前對(duì)細(xì)菌、酵母中GGT的研究較多，對(duì)香菇中GGT的研究較少，對(duì)其提取效率的研究更少。對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)及其酶學(xué)性質(zhì)研究有助于進(jìn)一步明晰甲醛在香菇風(fēng)味物質(zhì)形成途徑產(chǎn)生的機(jī)理，并且為開(kāi)發(fā)香菇甲醛產(chǎn)生的抑制方法提供科學(xué)的參考依據(jù)。而香菇中蛋白質(zhì)含量較低，要獲得足夠量且活力未嚴(yán)重?fù)p失的GGT粗酶液以供進(jìn)一步研究，提取效率的提高十分關(guān)鍵。已知GGT是廣泛存在于生物體內(nèi)參與谷胱甘肽循環(huán)的酶，該酶主要存在于細(xì)胞膜的外表面上，通過(guò)亞基和細(xì)胞膜相連[7]，使常規(guī)靜置提取法提取率較低。超聲波技術(shù)用于蛋白質(zhì)及酶的提取具有明顯的優(yōu)勢(shì)，與靜置提取法相比，超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)、攪拌作用等可以加速提取成分的釋放，提高提取率，有效縮短提取時(shí)間[8-10]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法改進(jìn)香菇中GGT的提取工藝，為深入研究GGT及香菇內(nèi)源性甲醛的形成機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇采自浙江慶元，經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎，保存于－70℃；γ-谷氨酰-對(duì)硝基苯胺(γ-glutamyl-P-nitroanilide)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)、對(duì)硝基苯胺(P-nitroanilide) 美國(guó)Sigma公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海新芝生物技術(shù)研究所；DELTA320 pH計(jì) 美國(guó)Mettler Toledo公司。

1.3 香菇GGT的提取方法

準(zhǔn)確稱取1.00g香菇粉置于100mL三角燒瓶中，加入一定量0.5mol/L Tris-HCl(pH 7.6)緩沖液，放置在冰浴環(huán)境中，用超聲輔助提取法提取GGT，將該提取液8000 ×g離心20min后取上清液測(cè)酶活，計(jì)算得率。

1.4 酶活測(cè)定方法及提取率計(jì)算

GGT催化γ-glutamyl-P-nitroanilide的產(chǎn)物P-nitroanilide在410nm處有吸光度[11]，酶活性由生成產(chǎn)物的量反映。反應(yīng)體系為0.5mol/L Tris-HCl(pH7.6)緩沖液4.0mL、酶液 0.5mL、3.5μmol/mL底物0.5mL，37℃反應(yīng)20min，加入3mL 1.5mol/L乙酸終止反應(yīng)，過(guò)濾后在410nm處測(cè)吸光度(A)。酶活單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1μmol的P-nitroanilide為1個(gè)酶活單位。

GGT提取率/(U/g)=樣品GGT活性/香菇粉質(zhì)量

1.5 單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)

超聲輔助提取法單因素試驗(yàn)分析不同料液比、提取時(shí)間、功率對(duì)GGT得率的影響。具體為稱取1.00g香菇粉，分別加入0.5mol/L Tris-HCl(pH7.6)緩沖液25、50、75、100、150mL，在4℃提取功率200W條件下提取10min；相同處理?xiàng)l件下，在4℃提取功率200W條件下分別提取5、10、20、30、40min；相同處理?xiàng)l件下，提取功率分別在50、100、150、200、250W條件下提取10min。根據(jù)單因素試驗(yàn)，結(jié)合Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化GGT的超聲輔助提取法料液比、提取時(shí)間和功率提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取GGT的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)GGT提取率的影響

設(shè)計(jì)料液比分別為1:25、1:50、1:75、1:100和1:150，在提取功率200W條件下超聲提取10min，以考察料液比對(duì)GGT含量的影響(圖1)。由圖1可知，隨著料液比的提高，GGT提取率不斷增加，當(dāng)料液比達(dá)到1:50后，進(jìn)一步增加溶液的量，溶液中GGT含量增加不明顯。高料液比條件下，GGT總的溶出量增加，提取過(guò)程中液相濃度增加快，兩相濃度差減少加快[12]。高料液比在一定程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但從提取效果、原料用量等方面綜合考慮，確定料液比1:50較適宜。

圖1 料液比對(duì)GGT提取率的影響Fig.1 Effect of material/water ratio on GGT extraction

2.1.2 提取功率對(duì)GGT提取率的影響

圖2 提取功率對(duì)GGT提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on GGT extraction

固定料液比1:50，提取功率分別為50、100、150、200、250W超聲提取10min，考察提取功率對(duì)GGT提取率的影響(圖2)。由圖2可知，提取功率對(duì)GGT提取率具有顯著的影響。功率越高，GGT提取率越高，兩者呈線性正相關(guān)關(guān)系。提取功率越高，對(duì)香菇細(xì)胞的破壞作用越大，溶劑擴(kuò)散也越快，越有利于GGT的浸出。當(dāng)功率大于200W時(shí)，進(jìn)一步增加提取功率，GGT提取率下降。這可能是因?yàn)檫^(guò)高的功率產(chǎn)生的瞬間高溫會(huì)使GGT的活性降低，因此，選擇200W為較佳的提取功率。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)GGT提取率的影響

固定料液比為1:50，在提取功率為200W條件下分別超聲提取5、10、20、30、40min，以考察提取時(shí)間對(duì)GGT提取率的影響(圖3)。由圖3可知，提取時(shí)間對(duì)GGT提取率有著顯著的影響，在30min時(shí)GGT提取率最大，而后隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，GGT提取率出現(xiàn)了明顯的下降趨勢(shì)。超聲促進(jìn)胞內(nèi)的GGT釋放并擴(kuò)散到胞外的溶劑中，大部分存在于破碎細(xì)胞內(nèi)的GGT在最初的30min內(nèi)釋放到提取溶劑中，因而GGT提取率在這段時(shí)間內(nèi)發(fā)生了顯著的增長(zhǎng)。但是過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用可能導(dǎo)致部分GGT結(jié)構(gòu)破壞，GGT活性也隨之下降，據(jù)此初步確定30min為較適宜的提取時(shí)間[13]。

圖3 提取時(shí)間對(duì)GGT提取率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on GGT extraction

2.2 采用響應(yīng)面法優(yōu)化GGT的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14-16]，利用Minitab15軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表Table1 Factors and levels in the response surface design

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table2 Response surface design matrix and experimental results

表3 回歸方程的方差分析Table3 Variance analysis of the developed regression model

用Design-expert 7.0 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析及方差分析，擬合得到回歸方程為Y=10.43＋0.47A＋2.13B－0.025C+0.31AB－0.53AC－1.23BC－1.88A2－6.11B2－0.80C2

從表3可以看出，回歸方程因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.9187)，方程P= 0.0285＜0.05，說(shuō)明此回歸方程顯著；失擬項(xiàng)P=0.0970＞0.05，說(shuō)明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合度較好，此實(shí)驗(yàn)方法可靠。

2.2.2 提取工藝的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

顯著因素水平的優(yōu)化運(yùn)用Design-expert 7.0 軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行規(guī)范性分析，尋求最大提取率的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，結(jié)合圖4～6給出的回歸方程的三維響應(yīng)面圖和等高線圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)即最大值。對(duì)回歸方程求極值點(diǎn)得：A=0.0968，B=－0.1811，C=0.0914，Y=9.897，即提取功率、提取時(shí)間、料液比的最佳值分別為204.84W、28.19min、1:52.29，此時(shí)GGT提取率達(dá)到最大值為11.19U/g。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，GGT平均提取率為11.07U/g，與理論值基本相符，這說(shuō)明回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對(duì)GGT提取率的影響。

圖4 提取功率與提取時(shí)間對(duì)GGT提取率交互影響效應(yīng)響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of ultrasonic power and extraction duration on GGT extraction

圖5 提取功率與料液比對(duì)GGT提取率交互影響效應(yīng)響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of ultrasonic power and material/water ratio on GGT extraction

圖6 提取時(shí)間與料液比對(duì)GGT提取率交互影響效應(yīng)響應(yīng)面立體分析圖及其等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of extraction duration and material/water ratio on GGT extraction

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選取料液比、提取時(shí)間、提取功率3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和Minitab15、Designexpert 7.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，得到超聲輔助提取GGT的最佳條件為：提取功率、提取時(shí)間、料液比的最佳條件分別為204.84W、28.19min、1:52.29。在最佳提取條件下，提取液中GGT的提取率達(dá)到11.19U/g，與理論值基本相符。這說(shuō)明回歸方程較真實(shí)地反映各因素對(duì)GGT提取率的影響。

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Optimization of Conditions for Ultrasonic-assisted Extraction of γ-Glutamyltranspeptidase from Shiitake Mushroom by Response Surface Methodology

LI Jian-rong，YIN Jie，ZHU Jun-li，ZHANG Qing
(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

In order to optimize the ultrasonic-assisted extraction of γ-glutamyltranspeptidase (GGT) from shiitake mushroom, single factor investigations were initially carried out, followed by construction of a three-factor, three-level Box-Benhnken experimental design, quadratic regression fitting for GGT activity as a function of three extraction conditions and response surface analysis. The optimal conditions for the ultrasonic-assisted extraction of GGT were found to be: ultrasonic power, 204.84 W; extraction duration, 28.19 min; and material/water ratio, 1:52.29. Under the above conditions, the experimental value of GGT activity was 11.19 U/g, which was in basic agreement with the model predicted value.

shiitake mushroom；γ-glutamyltranspeptidase；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

Q949.329.81；O658

A

1002-6630(2010)20-0020-04

2009-10-18

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(208054)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(R3090330)；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009IK180)

勵(lì)建榮(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品貯藏加工與安全控制及食品生物技術(shù)。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn